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左归降糖清肝方对糖尿病合并脂肪肝小鼠肝脏脂代谢相关基因

 
左归降糖清肝方对糖尿病合并脂肪肝小鼠
肝脏脂代谢相关基因mRNA 表达的影响#
喻嵘1,成细华2,程莉娟2**
基金项目:国家自然科学基金(No.81102593),中国博士后科学基金(No.20110491258),教育部博士学
科点科研基金(博导类)(No.20104323110002),
作者简介:喻嵘(1969-),女,教授,博士生导师,主要研究方向:中医药防治糖尿病及其并发症机理研

通信联系人:成细华(1974-),女,副教授,硕士生导师,主要研究方向:中医药防治糖尿病及其并发症
机理研究. E-mail: 1357655170@qq.com
5 (1. 湖南中医药大学科技处,长沙 410208;
2. 湖南中医药大学医学院,长沙 410208)
摘要: 目的 探讨以滋阴益气、清热利湿、化痰消瘀组方的左归降糖清肝方对高脂饮食2
型糖尿病转基因MKR 小鼠脂肪肝发生中脂代谢相关基因mRNA 表达的影响。方法 30 只
MKR 小鼠随机分为MKR 组、MKR 高脂组和左归降糖清肝方组;左归降糖清肝方组干预治
10 疗高脂饮食诱发脂肪肝的MKR 鼠4 周,RT-PCR 检测小鼠肝脏脂代谢相关基因mRNA 表达
变化。结果 ① MKR 高脂组小鼠较MKR 组肝脏ACC-α、FAS 和EDEM1 的mRNA 表达
增加,apoB100 mRNA 表达则降低;②左归降糖清肝方降低MKR 高脂组小鼠肝脏ACC-α、
FAS 和EDEM1 的mRNA 表达水平,增加apoB100 mRNA 的表达。结论 左归降糖清肝方
通过调节肝脏脂代谢相关基因 mRNA 表达,缓解肝脏脂肪性变。
15 关键词:中医内科学;左归降糖清肝方;糖尿病合并脂肪肝; 脂代谢; MKR 小鼠
 
0 引言
2 型糖尿病(type II diabetes mellitus, T2DM)可并发心脑血管、视网膜、肾脏、神经等
 
病变。其中,非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty 40 liver disease, NAFLD)也是常见的糖尿病
并发症,75% 的2 型糖尿病患者合并不同程度的脂肪肝 [1]。脂质异常及胰岛素抵抗(insulin
resistance, IR)是导致非肥胖T2DM 患者发生脂肪肝的危险因素[2]。调节脂代谢、改善IR 已
经成为当前治疗糖尿病及并发症方法及药物的研究热点之一。因此,根据NAFLD 是一种遗
传-环境-代谢应激相关性疾病,本研究以具有遗传变异的胰岛素抵抗2 型糖尿病小鼠MKR
45 鼠为实验对象,加上高脂饮食喂养,模拟临床人类2 型糖尿病合并NAFLD 的发生,建立
T2DM 合并NAFLD 动物模型[3],经左归降糖清肝方干预治疗后进行肝脏形态学检测以及脂
代谢相关基因mRNA表达检测,从分子水平探讨该复方影响脂代谢,缓解T2DM合并NAFLD
发生的机制。
1 材料与方法
50 1.1 动物
MKR 小鼠(采用组织特异过度表达转基因技术产生),由美国国立卫生研究院(Dr.D.
LeRoith)提供纯合子MKR 小鼠,经自然交配后繁殖的后代用于实验研究。试验用小鼠由湖
南中医药大学SPF 级实验动物中心饲养。饲养笼具、垫料、饮水的制备与消毒均符合SPF
级实验动物饲养要求。动物基础饲料加15%猪油,1%胆固醇。
55 1.2 药物和主要试剂
左归降糖清肝方由黄芪18g,山药12 g,熟地黄12 g,黄连6 g,丹参9 g,茵陈15 g
等10 味药组成,中药购自湖南中医药大学杏林药号。煎2 次,合并煎液,过滤浓缩至生药
2.4 g·mL-1,4℃冰箱贮存备用。动物组织总RNA 提取试剂盒(北京TIANGEN 生物技术公
司);逆转录试剂盒(Fermentas 公司);PCR 引物由上海生工公司合成;2×Taq PCR MasterMIX
60 (北京TIANGE 生物技术公司)。
1.3 实验分组
30 只经遗传鉴定的MKR 鼠8 周时根据性别、体质量,随机分为MKR 组、MKR 高脂
组和左归降糖清肝方组,每组10 只。MKR 高脂组和左归降糖清肝方均以高脂饲料喂养,
MKR 组以基础饲料喂养8 周,试验中无小鼠死亡。高脂饲料喂养4 周后,左归降糖清肝方
65 组以生药29.64 g·kg-1 ig,MKR 组和MKR 高脂组以等体积蒸馏水ig。ig 容量为0.5 mL
/20 g。每日定时ig 1 次,连续给药4 周。
1.4 肝组织形态学观察
取小鼠肝脏最大叶距边缘5mm 处肝组织,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,病理切片,
HE 染色后光镜观察,拍照。
70 1.5 RT-PCR 检测MKR 小鼠肝组织脂代谢相关基因的表达
取各组小鼠新鲜肝脏组织,用动物组织总RNA 提取试剂盒抽提其总RNA,采用紫外分
光光度计测定其浓度。取1 μg 总RNA,随后用逆转录试剂盒以Oligo(dT)为引物进行逆转录
反应。应用DNAStar 6.0 软件,根据GenBank 中小鼠的脂代谢相关靶基因乙酰辅酶A 羧化
酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC-α)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)、载脂蛋白B100
75 (Apolipoprotein B-100,apoB100 )和内质网甘露糖苷酶样蛋白1(ER degradation enhancer
mannosidasealpha-like 1, EDEM1)mRNA 序列设计PCR 引物(见表1),选择最适条件分别
 
对靶基因和内参基因β-肌动蛋白(β-actin)进行PCR 扩增,PCR 产物进行2.5%琼脂糖凝胶
电泳,凝胶扫描分析系统拍照并分析电泳条带灰度值,以靶基因与β-actin 电泳条带密度比
值计算各靶基因mRNA 相对表达量。
80
表1 靶基因表达分析引物序列
GenBank 序列号 基因 引物序列(5′→3′) 产物大小(bp)
NM_133360 乙酰辅酶A 羧化酶 GGAGGACCCAACAACAACAAT 200
(ACC-α) GATGCAATCTTATCCCCCAAAG
85 NM_007988 脂肪酸合酶 CCAAGTTCGACGCCTCCTTTTT 154
(FAS) ACCCAGACGCCAGTGTTCG
NM_009693 载脂蛋白B100 TCGAGCACAGATGACCAGAGT 201
(apoB100 ) CTTAGAAGCCTTGGGCACAT
NM_138677 内质网甘露糖苷酶样 CCAGATGGTTGGCTTGATT 141
90 蛋白1(EDEM1) AGAGCTGGACAGAAACTTCG
NM_007393.3 β-肌动蛋白 TGCTGTCCCTGTATGCCTCT 463
(β-actin) AGGTCTTTACGGATGTCAACG
1.6 统计学分析
95 所有实验数据用SPSS17.0 统计软件统计分析,结果用“ x ±S”表示,组间比较采用单
因素方差分析,方差不齐采用非参数检验。P<0.05 表示有显著意义,P<0.01 表示有极显著
意义。
2 结果
2.1 左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 小鼠肝脏病理形态的影响
100 结果见图1。光镜下可见:MKR 小鼠肝组织肝小叶结构正常,肝细胞规则排列,肝细
胞大小正常,胞核位于细胞中央。MKR 高脂组小鼠肝细胞则以弥漫性小泡性脂变为主。经
左归降糖清肝方干预治疗后,高脂饮食MKR 鼠肝组织脂肪性变程度明显改善。
105 NC MG ZG
注:NG:MKR 组,MG:MKR 高脂组,ZG:左归降糖清肝方组。
图1 肝组织病理形态学变化(HE,×400)
Fig. 1 Liver pathology morphology change
110 2.2 左归降糖清肝方对高脂饮食MKR 小鼠肝脏脂代谢相关基因mRNA表达的影响
与MKR 小鼠比较,MKR 高脂组小鼠肝脏脂代谢相关基因ACC-α、FAS、EDEM1 mRNA
表达明显上调,差异具有统计学意义(P< 0.05),而apoB100 mRNA 表达则显著下调,差
异具有统计学意义(P< 0.01);与MKR 高脂组比较,左归降糖清肝方组ACC-α、FAS 和
EDEM1 mRNA 表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05),apoB100 mRNA 表达上调,差
115 异具有统计学意义(P< 0.01)。结果见图2。
 
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
 
注:NG:MKR 组,MG:MKR 高脂组,ZG:左归降糖清肝方组,M:DNA Marker; 与MKR 组比较,*
P<0.05,* * P<0.01;与120 MKR 高脂组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
图2 左归降糖清肝方对MKR 小鼠肝脏脂代谢相关基因mRNA 表达的影响( x ±S,n=10)
Fig. 2 Effect of ZJQR on the expression of lipid metabolism related mRNA in the live of MKR mice
3 讨论
125 研究已表明,高脂饮食喂养MKR 小鼠糖耐量曲线异常,肝质量、肝指数、肝功能指标
(ALT、AST)和血脂水平均有不同程度升高,说明该小鼠体内的IR 和糖脂代谢紊乱进一
步加剧,更易使脂质流向肝脏并堆积,表现出明显的脂肪肝病变,与临床T2DM 合并NAFLD
极为一致[3]。因此,该小鼠模型可作为研究T2DM 合并NAFLD 的良好动物模型。本实验中,
肝脏病理形态学结果同样表明,高脂喂养的MKR 小鼠肝脏脂肪积蓄明显,肝细胞结构发生
130 改变,左归降糖清肝方干预后则能有效的改善肝脏脂质堆积现象。
脂肪肝的形成和发展通常伴随肝脏中糖脂代谢的异常,如脂肪酸合成增加和VLDL 分
泌的减少[4-6]。ACC-α 与FAS 是脂肪酸代谢过程中的关键酶,并受肝脏脂质代谢的重要核转
录因子的调控[7],参与许多脂质代谢的重要生理过程[8]。研究发现,高脂喂养的大鼠12 周后,
肝脏ACC-α 和FAS 基因在 mRNA 以及蛋白质水平上表达均显著升高,形成NAFLD[9]。本
135 实验中,高脂喂养的MKR 小鼠肝脏脂肪酸合成相关基因ACC-α 和FAS mRNA 表达水平显著
增加,表明其肝脏中出现脂代谢紊乱,引起肝脏内脂肪酸合成增加,脂质在肝脏内不断积累。
左归降糖清肝方干预治疗后,MKR 小鼠肝脏上述基因表达均显著降低,证明该复方能减少肝
脏脂肪酸合成。
VLDL 形成于肝脏,能转运输出肝脏合成的甘油三酯。ApoB100 则在富含甘油三酯的脂
140 蛋白VLDL 合成与分泌中发挥重要作用。另外,近年来研究表明内质网应激(endoplasmic
reticulum stress, ERS)作用可通过影响脂类合成与分解,在T2DM 并发脂肪肝中具有重要作
用[9-11]。内质网是蛋白质合成、折叠、运输以及储存钙的主要场所,对各种刺激极为敏感。
当机体功能紊乱时,出现错误折叠和未折叠的蛋白在腔内聚集以及细胞内钙平衡紊乱的状态
称为(endoplasmic reticulum stress, ERS)。适度的ERS 反应有助于保护细胞,维护生存,
145 但ERS 反应过强则可引起细胞功能障碍,导致细胞凋亡,促进疾病的发生发展[12]。EDEM1
是一种а-甘露糖苷酶样应激蛋白,能促进ERS 时产生的不完全折叠或错误折叠蛋白的降解,
是内质网相关性降解途径的标志分子之一[13]。毛刘峰等研究显示,高脂饮食T2DM 小鼠在
18 周龄时肝脏EDEM1 mRNA 表达显著增加,同时ApoB100 基因表达量显著降低,表明
T2DM 小鼠在脂肪肝的形成过程中存在肝脏内质网相关性降解增强,并导致ApoB100 蛋白
150 合成和分泌的减少,加速了脂肪肝的形成[10]。本实验中,高脂喂养的MKR 小鼠肝脏EDEM1
 
mRNA 表达较普通MKR 小鼠明显升高,ApoB100 基因mRNA 表达量显著降低,与毛刘峰
等的研究结果一致。左归降糖清肝方干预治疗后,可显著降低EDEM1 基因mRNA 水平的
表达,提高ApoB100 基因mRNA 水平的表达,其结果进一步证明该复方能对T2DM 合并
NAFLD 发生具有抑制作用。
155 在前期的临床研究与临床文献调研中,我们认为T2DM 合并NAFLD 的中医病机是:肝
肾阴虚、湿热内蕴、痰瘀互结(虚、痰、毒、瘀),其病位主要在肝脏,涉及脾肾,主要病
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