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灯盏乙素的微生物转化研究# 刘志辉，杨立国，陈丽霞，邱峰** 基金项目：教育部博士点基金（200801630004） 作者简介：刘志辉，（1984-），女，硕士，从事微生物转化研究。 通信联系人：邱峰，（1967-），男，教授，从事天然产物研究。 E-mail: fengqiu20070118@163.com （沈阳药科大学中药学院，沈阳 110016） 5 摘要：目的 利用黑曲霉对灯盏乙素转化制备代谢产物野黄芩素。方法 本研究采用黑曲霉对 灯盏乙素进行转化，通过各种色谱手段对发酵液的乙酸乙酯萃取部位进行分离，得到两个转 化产物，并通过理化性质及现代波谱手段鉴定了它们的结构。结果 经鉴定，两个转化产物 分别为野黄芩素和6-羟基木犀草素。 关键词：灯盏乙素；微生物转化；野黄芩素；黑曲霉 灯盏乙素（scutellarin）,又名野黄芩苷，为灯盏花素的主要有效成分，为临床上治疗心 脑血管疾病的有效药物[1-3]。前期研究发现野黄芩素是灯盏乙素在大鼠体内的主要一相代 25 谢产物，该代谢产物在体外难以通过野黄芩苷的常规酸水解制备获得[4-5]。而微生物转化 可利用微生物体内的酶系对外源性物质进行转化，产生与动物乃至人体内形成的相同的代谢 产物，因此，微生物转化对模拟药物体内代谢途径具有一定的预见性，已成为研究体内代谢 的一种重要的辅助工具[6]。本文在前期工作的基础上，通过黑曲霉对灯盏乙素进行转化， 得到了两个转化产物，并通过理化性质及现代波谱手段鉴定了它们的结构。一方面，为灯盏 30 乙素的体内代谢产物研究提供了新的途径；另一方面，得到了大量的野黄芩素和少量6-羟 基木犀草素，为其后续生物活性研究奠定了物质基础。 1 仪器与材料 1.1 实验仪器 分析型高效液相色谱仪：①泵为Waters 600 controller (Waters, USA)，检测器为Waters 35 996 photodiode array detector (Waters, USA)，色谱工作站为Millennium32 (Waters, USA)；制 备型高效液相色谱：①泵为PU-986 intelligent prep. pump (JASCO, Japan)，检测器为UV-975 intelligent UV/VIS detector (JASCO, Japan)，色谱工作站为N2000(浙大智达，中国浙江)；旋 转蒸发仪（型号N-1000，只适合水浴， EYELA, TOKYO）；循环水式多用真空泵（SHZ-D， 巩义市英峪予华仪器厂，中国巩义）；真空恒温干燥箱（YB-ⅠA，中国天津）；紫外分析 40 仪（ZF-C 三用型，上海康禾光电仪器有限公司，中国上海）；Agilent 1100-LC/MSDTrap SL mass spectrometer (Agilent, USA) ；Bruker ARX-300 和 Bruker ARX-600 型核磁共振谱仪 （Bruker, German）。 1.2 实验材料 Sephadex LH-20 (Pharmacia , Sweden )；分析型色谱柱为YMC C18 (250×4.6mm, 5μm) （郑 州英诺色谱实验技术有限公司，中国郑州）；制备型色谱柱： Inertsil 45 Prep-ODS C18 (20 × 250 mm, 10 m) (GL.Sciences Inc. USA)；氘代试剂为DMSO（含TMS）（上海皓素化学技术有限 公司产品，中国上海）；色谱纯甲醇为天津康科德科技有限公司、江苏汉邦试剂公司产品； 分析纯甲醇，乙醇，乙酸乙酯，正丁醇，冰醋酸等为天津大茂化学试剂厂产品；蒸馏水为学 校水站提供的纯净水，液相水为学校水站提供的纯净水经过重蒸后使用；实验用菌种黑曲霉 50 (Aspergillus niger AS 3.795)购自北京普通微生物菌种保藏中心；实验用灯盏花素由云南天然 药物制药实业公司提供。 2 方法 2.1 灯盏乙素的纯化 称取灯盏花素原料药（云南天然药物制药实业公司，灯盏乙素的质量分数＞89%）0.5g， 55 加5 倍量的蒸馏水，用25%碳酸氢钠试液调节pH 至7，使其完全溶解，过滤，滤液加5 倍 量无水乙醇沉淀，边加边搅拌，使沉淀完全，静置10 h，抽滤，过滤时用无水乙醇反复洗涤 三次，再将沉淀物转移至另一容器中，加入水和乙醇使沉淀溶解；再加20%盐酸调节pH1-2， 静置10 h，滤过，并用水洗至中性，烘干，即得精制灯盏乙素。经HPLC 测定，纯度在95% 以上[7]。 60 2.2 转化菌种的筛选 2.2.1 土豆液体培养基的制作 取新鲜土豆，去皮，切成小块，加入5 倍量水煮沸，保持沸腾状态30 分钟，用纱布过 滤残渣，滤液加水定容(每200 克土豆配制1 升培养液)，在定容前加入2%葡萄糖。将配好 的培养液进行分装，250mL 的锥形瓶可装入60mL 培养液，500mL 锥形瓶可装入100-150mL 65 培养液。用纱布及牛皮纸将瓶口封好，放入高压灭菌锅中灭菌。灭菌条件为115ºC 灭菌 30min。 2.2.2 预实验 将菌种由斜面固体培养基转移至装有60mL液体培养基的250 mL锥形瓶中，在160 rpm， 26ºC 条件下于摇床中培养2 天后，加入1mL 底物的(6.0mg/mL)乙醇溶液，继续在相同条件 70 下培养4 天。同时设置底物空白对照和菌空白对照，前者为未加入底物但加入了等量空白乙 醇的发酵液，后者为加入了底物但没有接入菌种的液体培养基，在相同条件下培养4 天。取 出摇瓶后将发酵液过滤，滤液分别用等体积乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，合并萃取液浓缩至 干得萃取物。将所得样品用适量甲醇溶解。对照组处理方法相同。与底物共薄层，以乙醇： 甲酸(2:1)为展开剂展开，FeCl3 为显色剂进行鉴别。 75 2.2.3 菌种的筛选 用上述方法对实验室的28 种菌株进行筛选，选择可将灯盏乙素转化为其苷元野黄芩素 的菌种做进一步的放大试验。 2.2.4 菌种筛选的结果 通过菌种筛选，发现黑曲霉(Aspergillus niger AS 3.795)对灯盏乙素的转化能力较强，利 80 用HPLC 对转化产物进行分析，结果显示黑曲霉将灯盏乙素转化为两个代谢产物，且其中一 种转化物产量较大，对底物的转化较为专一，原型基本没有残留。采用有机溶剂对发酵液进 行液液萃取，发现所需目标成分的转化点全部集中在乙酸乙酯层，正丁醇层没有转化产物。 因此本实验将采用乙酸乙酯为萃取溶剂，对发酵液进行萃取。 2.3 给药后培养时间和给药量的考察 85 给药后培养时间和给药量会影响底物转化率，甚至还会影响转化产物的种类和比率，因 此考察给药后培养时间和给药量具有重要意义。 设置给药后培养时间为分别培养1 天、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天的梯度，到时间后 过滤菌丝体，并用乙酸乙酯萃取，萃取物留待考察。 150mL 培养液给药量设置梯度为4 mg、6 mg、8 mg、10 mg、12 mg，培养时间为6 天， 90 到时间后过滤菌丝体，并用乙酸乙酯萃取，萃取物留待考察。 经过聚酰胺薄膜层析平行操作对比，在给药量为8~12 mg，给药后培养时间为6 天时转 化比较完全，且转化点均已出现。最终选择该条件对底物进行转化。 2.4 灯盏乙素转化产物的累积和分离 菌种接入500mL 锥形瓶中培养，培养条件与预实验相同，2 天后加入底物，每瓶培养 95 液中给药约10 mg(将底物用乙醇溶解为10 mg/mL 的溶液，总的投药量约为1.0 g)，继续培 养6 天，过滤发酵液，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液，减压浓缩得总浸膏。 总浸膏经凝胶柱色谱（甲醇洗脱）分离得Ql-1、Ql-2、Ql-3 和Ql-4 四个流分，Ql-4 经PHPLC （甲醇：水=40:60+0.05%HAc）纯化，得到2 个转化产物QL-1 和QL-2，通过理化性质和 现代波谱学手段(UV，1H-NMR，13C-NMR)鉴定了转化产物的结构。 100 2.5 转化产物的结构鉴定 QL-1 QL-2 105 转化产物QL-1 为黄色粉末， UV：λmaxnm(MeOH)：279nm，345nm；FeCl3 反应显阳性， 盐酸-镁粉反应阳性，提示该化合物为黄酮类化合物。HR-ESIMS(positive)给出准分子离子峰 m/z 303.0584 [M+H]+。 在1H-NMR 中，δ 6.62(1H, s)为黄酮3 位氢信号。δ 7.39 (1H, d, J = 8.0 Hz)，6.88 (1H, d, J = 8.0 Hz)，7.38(1H, s)为B 环上的ABX 耦合系统的三个氢信号。δ 6.52 (1H, s)信号为8 位氢 110 信号。碳谱中一共显示黄酮母核的十五个碳信号，化学位移分别位于δ163.8，102.3，181.9， 147.1，129.1，153.4，93.7，149.6，104.0，121.9，113.3，145.7，149.5，116.0 和δ118.8。 将化合物QL-1 的核磁数据与文献[8]相比较，基本一致，由此确定该化合物为6-羟基木犀 草素（6-hydroxy-luteolin）。碳氢信号归属见Table 1。 转化产物QL-2 为黄色粉末，紫外吸收峰为：281nm，336nm。FeCl3 显色呈阳性，提示 115 该化合物结构中存在酚羟基。HR-ESIMS(positive)给出准分子离子峰m/z 287.0645 [M+H]+。 将其与野黄芩素（前期工作分离得到）[5]共薄层Rf 值一致（乙醇：甲酸=2:1），并与野黄 芩素通过HPLC-PDA 合并液相分析。结果显示：二者保留时间一致，且紫外吸收相同，推 测可能为同一化合物。因而该转化产物的结构确定为：野黄芩素（scutellarein）。 120 表1 化合物QL-1 的氢谱(300MHz)和碳谱(75MHz)数据(DMSO-d6) Table 1 1H-NMR (300MHz) and 13C-NMR (75MHz) data of compound QL-1(DMSO-d6) NO. 1H 13C 2 163.8 3 6.62(1H,s) 102.3 4 181.9 5 147.1 6 129.1 7 153.4 8 6.52(1H,s) 93.7 9 149.6 10 104.0 1’ 121.9 2’ 7.38(1H,s) 113.3 3’ 145.7 4’ 149.5 5’ 7.39(1H,d,J=8.0Hz) 116.0 6’ 6.88(1H,d,J=8.0Hz) 118.8 3 小结与讨论 3.1 本实验利用液液萃取、Sephadex LH-20 柱色谱、高效液相色谱等手段共从黑曲霉 125 (Aspergillus niger AS 3.795)的灯盏乙素发酵液中分离得到两个化合物，并根据理化性质和波 谱性质鉴定了它们的结构，分别为6-羟基木犀草素和野黄芩素。 3.2 在微生物转化过程中，微生物自身会产生大量的内源性物质，给提取分离工作带来 不便，本实验将液液萃取后的发酵液经Sephadex LH-20 柱色谱处理后，即可起到除去发酵 液中内源性物质的作用，减少了内源性物质对代谢产物分离的干扰。 130 3.3 药代动力学研究[5]表明，灯盏乙素口服给药后，可能先被肠道菌水解为苷元，即野 黄芩素，然后以苷元的形式吸收而发挥药理作用。本研究通过对菌种的筛选，利用微生物发 酵法转化灯盏乙素，模拟肠道微生物转化苷的过程，有利于阐明灯盏乙素在肠道内转化的过 程，使药物作用机制更加明确。 3.4 本研究利用微生物发酵法转化灯盏乙素，能够在常温、常压等较为温和的条件下大 135 量制备野黄芩素，有利于环境保护，降低了生产成本。 3.5 通常情况下，葡萄糖醛酸苷较难水解（与葡萄糖苷比较），本研究利用黑曲霉很容 易将灯盏乙素水解，为葡萄糖醛酸苷类化合物的水解提供了一条新途径。 [参考文献] (References) 140 [1]张人伟，张元玲，王杰生等.灯盏花黄酮类成分的分离鉴定.中草药，1988,19(5)：199-201. [2]来国防，程宾，王易芬等.灯盏花的研究进展.商丘师范学院学报，2010,26(6)：82-87. 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
