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灯盏乙素肠道菌群体外代谢研究# 刘志辉，杨立国，陈丽霞，邱峰** 基金项目：教育部博士点基金（200801630004） 作者简介：刘志辉，（1984-），女，硕士，从事微生物转化研究。 通信联系人：邱峰，（1967-），男，教授，从事天然产物研究。 E-mail: fengqiu20070118@163.com （沈阳药科大学中药学院，沈阳 110016） 5 摘要：目的 利用大鼠肠道菌群对灯盏乙素进行体外代谢研究。方法 本研究通过肠内菌群温 孵法对灯盏乙素进行体外代谢研究，应用HPLC 法对温孵产物进行检测。结果 大鼠肠内菌群 可以使灯盏乙素中的葡萄糖醛酸水解，转化成为其苷元。结论 灯盏乙素口服给药后，先被 肠道菌群水解为相应的苷元，然后以苷元的形式吸收进入体内。 关键词：灯盏乙素；肠道菌群；代谢；野黄芩素 灯盏乙素（scutellarin），又名野黄芩苷，为灯盏花素的主要有效成分，为临床上治疗 心脑血管等疾病的有效药物[1-2]。药代动力学研究表明，灯盏乙素口服吸收差，生物利用度 25 极低[3]，药效作用时间短，因此大部分研究工作多集中于改变其剂型，提高生物利用度， 延长药效作用时间。然而，本实验室前期研究发现黄酮苷类化合物口服给药后，可能先被肠 道菌群水解为相应的苷元，然后以苷元的形式吸收进入体内[4-5]。为证实该推测的正确性， 有必要对灯盏乙素进行肠道菌群体外代谢研究。本实验室采用烛缸法对大鼠肠道菌群进行厌 氧培养，然后将灯盏乙素与该菌群一同温孵培养，再利用HPLC 检测温孵产物，以验证上述 30 推测的正确性。 1 仪器与材料 1.1 实验仪器 恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂）；Waters 600 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； PDA996 检测器（美国Waters 公司）；Millennium32 色谱工作站（美国Waters 公司）；N-1000 35 旋转蒸发仪（EYELA, TOKYO）；循环水式多用真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；超净 操作台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）。 1.2 实验材料 牛肉膏（北京奥博生物技术有限责任公司）；大豆蛋白胨（北京奥博生物技术有限责任 公司）；可溶性淀粉（天津市科密欧化学试剂有限公司）；盐酸-L-半胱氨酸（曹杨第二中 40 学化工厂 中国上海）；氯化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾（沈阳化 学试剂厂）；葡萄糖（天津大茂化学试剂厂）；乙酸乙酯（天津大茂化学试剂厂）；甲醇（天 津大茂化学试剂厂）；灯盏乙素（由灯盏花素制备[6]得到，纯度＞95%；灯盏花素由云南天 然药物制药实业公司提供）；试验用大鼠为Wistar 雄性大鼠，由沈阳药科大学动物实验中 心提供；实验用代谢笼为苏州动物实验仪器厂产品。 45 2 方法 2.1 厌氧培养液的制备 牛肉膏2.2g，胰蛋白胨10g，消化血清粉13.5g，葡萄糖3g，牛肝浸出粉1.2g，氯化钠 3g，磷酸二氢钾2.5g，可溶性淀粉5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g，硫代乙醇酸钠0.3g。 准确称取以上各成分，加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，并转移至1000 mL 50 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，调节pH 为7.1-7.4。即得到厌氧培养液。 2.2 混合菌群的制备 2.2.1 培养基的制备 按照“厌氧培养液的制备”方法，配制500 mL 的厌氧培养液，分装在250 mL 的锥形 瓶中，每瓶含培养液100 mL，置于高压灭菌锅中，115 ℃灭菌30 min，自然冷却后，备用。 55 2.2.2 混合肠道菌的制备 取样前使Wistar 大鼠空腹12h，喂食馒头，1 天后取大鼠新鲜粪便5g，立即将其挤压使 之匀质化。按照1g：4mL 的比例将粪便与生理盐水混合制成混悬液。取2 mL 新鲜配制的粪 便混悬液，加入到事先配制好的培养液中，即得到肠菌培养液[7]。 2.3 样品液的制备 60 将底物灯盏乙素用少量pH 为7.1-7.4 的磷酸盐缓冲溶液溶解，每瓶培养液中加入10 mg 灯盏乙素。同时设置菌空白对照组，为未加入底物但加入了等量空白磷酸盐缓冲液的肠菌培 养液。分别培养2 天、4 天、7 天。 2.4 灯盏乙素与肠道菌群的温孵培养 采用烛缸法，将已制备完成的肠菌培养液置于干燥器内，并放入点燃的蜡烛，用凡士林 65 涂抹于干燥器边缘密封，蜡烛经几分钟后自行熄灭，然后将干燥器放入35℃恒温培养箱内 即可。 2.5 样品预处理及代谢产物的HPLC 检测 将发酵液过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液减压浓缩至干得萃取物。 将所得样品用适量甲醇溶解。空白对照组处理方法同上。 70 HPLC 检测条件：色谱柱为大连Elite C18 柱；柱温为室温；流速为1 mL/min。 采用梯度洗脱的方式： 流动相：A（5% Methanol，containing 0.05% Acetic acid） B（90% Methanol，containing 0.05% Acetic acid） 表1 HPLC 梯度洗脱方式 Table 1 The gradient program of HPLC 时间(min) Solvent A Solvent B 0 100 0 40 0 100 3 小结与讨论 80 3.1 实验结果（培养4 天） 图1 灯盏乙素与野黄芩素合并色谱图 Fig 1 Combined HPLC chromatogram of scutellarin and scutellarein 85 图2 肠道菌温孵空白色谱图 Fig 2 HPLC chromatogram of incubated metabolites of blank intestinal flora 图3 灯盏乙素与肠道菌温孵产物色谱图 Fig 3 HPLC chromatogram of incubated metabolites of scutellarin and intestinal flora 3.2 厌氧菌培养的方法很多，通过文献查阅主要有以下几种： (1)简单的厌氧培养法： 疱肉培养法：是一种简便的厌氧培养方法。即将精瘦牛肉或猪肉经处理后配制成疱肉培 养基，其中既含有易于被氧化的不饱和脂肪酸能吸收氧，又含有谷胱甘肽等还原性物质可形 95 成负氧化还原电位势差，再加之将其培养基煮沸驱氧以及用凡士林封闭液面，可用于厌氧菌 的培养。 铁丝圈厌氧培养法：将铁丝圈在酸性条件下与硫酸铜溶液进行反应，在铁丝圈的表面镀 上一层赤铜，在空气中极易被氧化，从而可吸收密封容器中的氧形成厌氧环境。 焦性没食子酸法：将焦性没食子酸与碱溶液（KOH，NaOH，Na2CO3）作用，生成易被 100 氧化的碱性没食子酸盐，通过氧化作用产生黑褐色的焦性没食子酸起到除去密封容器中的氧 的作用，制造出厌氧的环境。 (2)二氧化碳培养法： 烛缸法：是一种利用物理化学方法除去封闭环境中游离氧的方法。即将已接种好的培养 基置于干燥器内，并放入点燃的蜡烛；用凡士林涂抹于干燥器边缘密封，蜡烛经几分钟后自 105 行熄灭，然后将干燥器放入35℃恒温培养箱内即可。 化学法：按照每升容积加入碳酸氢钠0.4g 和浓盐酸0.35mL 的比例，连同接种好的培养 基分别置于干燥器内，用凡士林涂抹于干燥器边缘密封，倾斜容器，使浓盐酸与碳酸氢钠接 触生产二氧化碳，从而制造利于细菌生长的无氧环境。 二氧化碳培养箱：是特制的培养箱，既能调节二氧化碳的含量，又能调节所需温度。从 110 钢瓶通过培养箱的二氧化碳运送管进入培养箱内，调节所需二氧化碳浓度，将培养基直接放 入培养箱中培养即可。 综合上述方法，根据本实验室现有条件，在不影响混合肠道菌群生长的条件下，最终选 择烛缸法培养。 3.3 通过HPLC-PDA 分析检测可以看出，灯盏乙素与其苷元-野黄芩素的保留时间分别 115 为8.36min 和13.58min，而与空白培养液相比较，灯盏乙素在大鼠肠道菌群厌氧条件下培养 4 天后，在保留时间为13.50min 时也可以检测到其苷元-野黄芩素的色谱峰，且紫外吸收相 同。据此可以推测大鼠肠内菌群可以使灯盏乙素结构中的葡萄糖醛酸水解，转化成为其苷元 野黄芩素，之后被肠道吸收。 3.4 通常情况下，葡萄糖醛酸苷很难水解（与葡萄糖苷等相比），本研究发现其在肠菌 120 作用下较易水解，为水解葡萄糖醛酸苷提供了一条新途径。 [参考文献] (References) [1] 张人伟, 张元玲, 王杰生等. 灯盏花黄酮类成分的分离鉴定[J].中草药,1988,19,（5）:199-201. [2] 何蔚, 曾繁典. 灯盏花素治疗缺血性脑血管病的药理作用和临床研究[J].中国临床药理学杂 125 志,2002,18(6):458-461. [3] 葛庆华, 周臻, 支晓瑾等. 灯盏花素在犬体内的药动学和绝对生物利用度研究[J].中国医药工业 杂志, 2003,34(12):28-30,42. [4] 夏红军, 朱珊, 梁建谋等. 大鼠灌胃灯盏花素后血浆、胆汁、尿液及粪便中代谢产物的鉴定. 中草药, 2009, 40 (9) : 1362-1366. 130 [5] Hongjun Xia, Feng Qiu, Shan Zhu. Isolation and Identification of Ten Metabolites of Breviscapine in Rat Urine. Bio.pharm.bull. 2007, 30(7): 1308-1316. [6] 张人伟, 程慧佳, 樊献俄. 高纯度灯盏花乙素原料药的制备工艺. 中国：CN1317289C [7] 李丽萍. 菊花提取物效应成分的代谢及动力学研究[D]. 浙江大学药学系. 2006. 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
