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表面PEG修饰密度对脂质体体内外性质的影响

 
表面PEG 修饰密度对脂质体体内外性质的
影响#
袁雯旻,蒯锐,唐洁,何勤**
基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20090181110083)
作者简介:袁雯旻,(1982-),女,博士研究生,新型给药系统与靶向制剂。
通信联系人:何勤,(1968-),女,教授,新型给药系统与靶向制剂。E-mail: qinhe317@126.com
5 (四川大学华西药学院靶向药物及释药系统教育部重点实验室,成都 610041)
摘要:PEG 是一种被广泛用于脂质体表面修饰的高分子材料,PEG 化(PEGylation)的主要
作用之一是增加脂质体在体内的循环时间。但当引入PEG 的密度发生改变时,脂质体的粒
径、形态、载药性能、体内药动学特征、体内分布、在细胞和亚细胞水平的作用特征等也会
随之变化,从而影响到PEG 化的脂质体作为载药系统的整体功能的发挥。因此,本文就PEG
10 密度对脂质体性质的影响综述如下。
关键词:药剂学;PEG 密度;PEG 化;脂质体;靶向性
 
0 引言
自20 世纪90 年代被用于脂质体等纳米载体表面修饰以来[1-10],PEG (Poly ethylene glycol,
30 聚乙二醇)开始受到越来越广泛的关注。PEG 化(PEGylation)的脂质体最显著的变化是具
有更长的体内循环时间,这是因为PEG 在脂质体表面可以形成惰性的亲水层[11],该亲水层
可以减少脂质体与血浆蛋白质的结合从而减少脂质体被网状内皮系统(reticuloendothelial
system, RES)摄取[12-16]。然而PEG 本身性质的改变,如分子量,密度,构象,PEG 所连接的
脂质种类等,都会影响到所修饰脂质体的粒径、形态、载药性能、体内药动学特征、体内分
35 布、在细胞和亚细胞水平作用的特征等,并最终影响到脂质体作为载药系统的整体功能的发
挥,只有充分了解PEG 引入所带来的影响及其影响的规律性,才可能扬长避短,开发出更
好的药物输送系统。其中,与PEG 化脂质体性质最为息息相关的影响因素之一就是PEG 的
密度,因此,本文将不同密度PEG 引入后对脂质体性质的产生的影响及其规律综述如下,
为今后脂质体载药系统的研发和PEG 的应用提供参考。
 
40 1 PEG 密度对脂质体理化性质的影响
1.1 PEG 密度对脂质体的粒径的影响
脂质体粒径随着PEG 密度的增加而减小。由于PEG 链在水相中是动态的,随着PEG
密度的增加,脂双层表面的排斥程度也相应增加,为了减少排斥的程度,脂质体的粒径变小
以增加表面的曲率,使脂双层变得更加稳定。S. Sriwongsitanont 等[17-18]的研究表明,脂质体
45 的平均粒径取决于DSPE-PEG2000 的密度。没有PEG 修饰的EPC 脂质体粒径约为205nm,
而当有30%mol PEG 脂质时粒径约为48nm(图1 a)。另外,DMPC 脂质体的粒径随PEG
浓度的变化趋势也与EPC 相似,但是变化的强度更为剧烈。当PEG 的浓度从0%增加到30%
时,DMPC 脂质体的平均粒径从10um 降低于到了约30nm(图1 b)。邓意辉等[19]用不同浓
度的PEG-胆固醇脂质(PEG-Cho lipids)制备脂质体时也观察到了类似的现象:即随着PEG 密
50 度的增加脂质体的粒径逐渐变小。
图1: PEG 密度对脂质体粒径的影响。(a) DSPE-PEG2000 密度对EPC/DSPE-PEG2000 脂质体粒径的影响;(b)
DSPE-PEG2000 密度对DMPC/DSPE-PEG2000 脂质体粒径的影响。
55
1.2 PEG 密度对脂质体的形态的影响
脂质体的形态会随着PEG 密度的改变而变化。DMPC/PEG 脂质体的电镜照片[17]显示了
脂质体形态随PEG 密度的变化过程。在没有PEG 的情况下,DMPC 聚集成簇状的无规则多
室脂质体,而适量PEG 的加入让脂质体变得更加圆整,并逐渐成为单室脂质体。当PEG 超
 
过20%时,脂质体的形态又开始变得不规则。S. Sriwongsitanont 60 等[17-18]认为随着PEG 的加
入也导致了室间排斥的增加,结果使得脂质体逐渐变为单室脂质体(图2)。
图2: 不同PEG密度修饰的DMPC/DSPE-PEG2000脂质体的冰冻蚀刻显微照片。0%(a), 1% (b), 5%(c), 10%(d),
20%(e), 30%(f)。
65
PEG 在脂质体表面的密度还影响着PEG 的构象。对粒径100nm 左右的DSPE-PEG2000
修饰的脂质体而言,当DSPE-PEG2000 的密度在4%以下时,脂质体表面的PEG 处
于”mushroom”构象;当DSPE-PEG2000 的密度在8%以上时,PEG 处于 “brush”构象;而当
DSPE-PEG2000 的密度在4%-8%时,PEG 处于两者之间的过渡态(图3)。“Brush”构象可以保
70 证脂质体表面被完全覆盖,避免脂质体受到调理作用。然而,要想制备稳定的具备“brush”
构象的脂质体是十分困难的。这是因为当PEG 处于“brush”构象时,PEG 链之间的斥力非常
大,这种斥力足以破坏脂双层[19-20]。Leaf Huang 等[19]通过内核与脂双层的“电荷-电荷”相
互作用稳定了脂双层,成功制备了表面密度达10.6%的处于”brush”构象的LPD 脂质体纳米
粒系统。
 
图3:PEG 密度和构象的关系示意图
1.3 PEG 密度对包封率的影响
Arthur R 等[21]研究了PEG 对包封率的影响。图4 显示了葡萄糖的相对包封率与
DPPE-PEG5000 mol% 和DPPE-80 PEG2000 mol% 的函数关系。以没有DPPE-PEG5000 或
DPPE-PEG2000 时的脂质体中葡萄糖与脂质的重量比作为基准值,其它处方中葡萄糖与脂质
的重量比与这个基准值的百分比称为相对包封率。图4 显示PEG 脂质的加入非常明显地降
低了脂质体中葡萄糖的包封率。对DPPE-PEG5000 修饰的脂质体而言,当PEG 脂质在0~2.5%
时,包封率的降低最为明显;而对DPPE-PEG2000 而言,当PEG 在4-6%时,包封率的降低
85 最为明显。
 
图4:PEG 密度对脂质体包封率的影响示意图。(a) DPPE-PEG5000 密度对脂质体包封率的影响;(b)
DPPE-PEG2000 密度对脂质体包封率的影响。
90
2 PEG 密度对脂质体体内药动学和体内分布的影响
2.1 PEG 密度对脂质体体内半衰期的影响
PEG 修饰可以延长脂质体的体内半衰期已被大量研究所证实,并且PEG 密度在一定程
度上决定了脂质体体内半衰期的长短。Nancy Dos Santos 等[22]研究了0.5-5%mol 的
95 DSPE-PEG2000 对DSPC/DSPE-PEG2000 脂质体在Balb/c 体内的循环时间的影响。结果表明,
随着DSPE-PEG2000 的加入,即使比例只有0.5%,也能极大地增加脂质体的循环时间。例如,
仅含有0.5%mol DSPE-PEG2000的DSPC脂质体的曲线下面积(AUC0-24h)比100%mol 的DSPC
脂质体的要高5.7 倍。随着DSPE-PEG2000的增加,AUC0-24h也进一步增加,并且在2%和5%mol
的DSPE-PEG2000 时达到坪值,AUC0-24h 分别约为41.3 和45.8umol.h.ml-1。注射24h 后5%,
100 2%,1%和0.5%molDSPE-PEG2000 脂质体在血浆中的残余百分比分别是30%,26%,18%,
13%。所有的结果均与没有加入DSPE-PEG2000 时有显著性差异(p<0.05) (图5)。
 
图5:不同PEG 密度对DSPC/DSPE-PEG2000 脂质体在血液中清除速率的影响。
0%mol(□);0.5%mol(▽);1%mol(△);2%mol(○);5%mol(◇)
105
2.2 PEG 密度对脂质体体内分布的影响
PEG 化的脂质体可以减少其在肝、脾的分布,延长其在血液中的循环时间,并通过EPR
效应(enhanced penetration and retention effect)增加其在肿瘤部位的蓄积,因此PEG 化脂质体
被广泛应用于肿瘤的靶向性研究中[23]。然而,虽然与未进行PEG 修饰的脂质体相比,PEG
110 化脂质体的肿瘤靶向性相对增加,但其注射剂量的绝大部分仍然蓄积在肝、脾等部位,而在
肿瘤部分相对很少。有研究通过增加PEG 密度以改变这一现象并取得了较好的效果。
Shyh-Dar Li 等[19]制备了表面PEG 密度高达10%的LPD(liposome-polycation-DNA),脂质
体表面PEG 密度为10%时处于”brush”构象,调理化的程度(与血浆蛋白结合的程度)很低,
因此,该LPD 能够将siRNA 高效地运载到肿瘤,而肝、脾等的摄取很低。肿瘤的摄取已经
115 大大超过肝脏的摄取,成为纳米粒从循环中消除的主要方式。因此,调节脂质体表面的PEG
密度,可以改变其在体内各组织器官的分布情况,从而更好的实现脂质体的靶向传递。
2.3 PEG 密度对脂质体多次给药时药动学及分布的影响
PEG 化的脂质体在体内的动力学与免疫系统的反应密切相关。Ishida 等[24-26]证实PEG
化的脂质体在重复注射时脂质体会迅速从血液中被清除。第二次注射时从血清中加速清除的
120 效应(Accelerated blood clearance effect,简称ABC 效应)该现象是由PEG 特异性的IgM 引
起的,IgM 会在第一次给药时产生并伴随着补体系统的激活,从而影响第二次注射时脂质体
的动力学特征,且从循环系统中清除的脂质体主要在肝蓄积。免疫系统对PEG 化的纳米药
物的应答势必会对它们在体内的药动学和体内分布产生负面影响。Shyh-Dar Li 等[1]认为如果
脂质体表面的PEG 密度较高,处于”brush”构象时,IgM 将不能与脂质体结合(不能发生调
125 理化),然而这一假说还有待证实。此外,邓意辉等[27,28]将酯酶敏感的可断裂PEG 脂质衍
生物用于修饰脂质体,当该脂质体进入体内后,PEG 会逐渐从脂质体表面断裂脱离,脂质
体表面的PEG 量相对减少。该研究中,多次向大鼠注射脂质体后,未见明显的ABC 效应产
生。这些结论说明PEG 的密度与ABC 效应有一定的关系,采用敏感性可断裂PEG 代替传
 
统的PEG 不仅可以延长纳米载体在体内的循环时间,而且在克服“ABC”效应上具有广阔
130 的前景。
3 PEG 密度对脂质体在细胞水平和亚细胞水平的行为的影响
PEG 引入脂质体会妨碍其与细胞的直接接触,PEG 的密度越高,脂质体表面的空间阻
碍越大,细胞对其的摄取也随之减弱。张强等[29]分别用不同比例的DSPE-PEG(0%, 2%, 3%,
4%, 5% and 6%)修饰载siRNA 的阳离子脂质体,研究结果表明,以2%的PEG 修饰的脂质
135 体的细胞摄取最强,随着PEG 比例的增加,脂质体表面的空间阻碍增强,细胞对其摄取逐
渐降低。
同时,PEG 的空间位阻还会影响脂质体的脂质成分与内吞体膜的融合而阻碍基因等药
物释放到细胞质。L.Y. Song 等[30]系统研究了PEG 对脂质体在亚细胞(细胞器)水平的作用
的影响。研究结果表明,相比于未用PEG 修饰lipid/DNA,用5%mol 的PEG 脂质修饰
140 lipid/DNA 的转染率显著降低,并且使用激光共聚焦对细胞进行观察发现,未用PEG 修饰的
载FITC-ODN 的脂质体的荧光信号主要浓集于细胞核,而PEG 化脂质体的荧光信号与内吞
体/溶酶体在同一位置,核内在任何时候都没有信号,说明5%molPEG 引入脂质体后影响了
ODN 从内吞体/溶酶体内的释放。张强等[29]等的研究也表明PEG 密度的增加会影响到脂质
体从内吞体/溶酶体内的释放能力,而当PEG 密度为2%时,从细胞摄取6h 后的共聚焦图片
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