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花色苷对高糖培养视网膜Müller 细胞谷氨 酸转运体mRNA 表达的影响# 文小凤1，柯敏1，钱志刚2** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（200804860040） 作者简介：文小凤（1987-），女，主要研究方向：眼底病 通信联系人：柯敏（1966-），女，主任医师，主要研究方向：眼底病. E-mail: keminyk@163.com 5 （1. 武汉大学中南医院眼科，武汉，430071； 2. 襄樊市中心医院眼科，湖北 襄樊 441021） 摘要：目的 观察花色苷对高糖培养视网膜Müller 细胞谷氨酸转运体mRNA 表达的影响。 方法 体外进行视网膜Müller 细胞的培养，将实验分为正常对照组（A 组）、高糖对照组（B 组）、高糖+30μmol/L 花色苷组（C 组）、高糖+60μmol/L 花色苷组（D 组）、高糖+100μmol/L 10 花色苷组（E 组）进行。采用逆转录聚合酶链反应方法（RT-PCR）检测高糖培养视网膜Müller 细胞经不同浓度花色苷处理后GLAST mRNA 表达的差异。 结果 B 组视网膜Müller 细胞 GLAST mRNA 的相对表达量较A 组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。随着花色苷 浓度的增加，GLAST mRNA 的相对表达量逐渐增加，花色苷浓度为60μmol/L 时，GLAST mRNA 的相对表达量达到最大值，之后当花色苷浓度继续增加为100μmol/L 时，GLAST 15 mRNA 的相对表达量反而下降。结论 花色苷可以上调高糖培养视网膜Müller 细胞谷氨酸转 运体mRNA 的表达。.. 关键词：病理生理学；花色苷；糖尿病视网膜病变；视网膜Müller 细胞；谷氨酸转运体 mRNA.. 中图分类号：R965.2.. 20 Effect of Cyanin on the expression of GLAST mRNA in high glucose cultured-Retina Müller cells WEN Xiaofeng1, KE Min1, QIAN Zhigang2 (1. Department of Ophthalmology, Zhongnan Hospical, Wuhan University, Wuhan 430071, China; 25 2. The Department of Ophthalmology of Xiang fan Centrer Hospital, Hubei Xiangfan 441021, China) Abstract: Objective To investigate the effect of Cyanin on the expression of GLAST mRNA in high glucose cultured-Retina Müller cells in vitro. Methods In vitro, we cultured retina Müller cells. The cultured Müller cells were divided into 5 groups, then incubated with 5 different cultivation liquid. The expression of GLAST mRNA in Müller cells was detected by RT-PCR. 30 Results Comparing with the group of normal level glucose, the expression of GLAST mRNA in cultured retinal Müller cells was significantly decline in high level glucose groups(P<0.05);.In Cyanin treated groups , the expression of GLAST mRNA was increased gradually, and at concentration of 60μmol/L, the expression of GLAST mRNA had got to the maximum. The expression of GLAST mRNA decreased at the concentration of 100μmol/L. Conclusion Cyanin 35 may inhibit the decrease of the expression of GLAST mRNA in Retina Müller cells which caused by high glucose. Key words: Physiopathology；Cyanin；Diabetic retinopathy；Retina Müller cells；GLAST mRNA 0 引言 40 视网膜Müller 细胞是视网膜内的主要神经胶质细胞，具有维持视网膜内环境稳定的重 要作用[1]。在糖尿病视网膜病变(DR)早期，Müller 细胞调控谷氨酸循环的功能受到损伤，引 起谷氨酸浓度升高，导致神经节细胞的死亡[2,3]。其中一个主要机制为Müller 细胞L-谷氨 酸/L-天门冬氨酸转运体（GLAST）的功能受损[2,3]。花青素(anthocyanidin)是一类广泛存 在于植物中的水溶性色素，是黄酮类中的多酚化合物。自然条件下游离的花青素极少 45 见，常与单糖形成糖苷，即花色苷(anthocyanin)[4]。既往的研究显示，花色苷具有抗 氧化、抗炎、抗突变、降血糖、防治心脑血管疾病、促进视力等多种药理作用[5-9]。 因此，我们利用体外培养的大鼠视网膜Müller 细胞作为研究载体，观察花色苷对高糖培 养下视网膜Müller 细胞GLAST mRNA 表达的影响，为将来寻找防治DR 可能的靶点打下 基础。现将结果报道如下。 50 1 材料和方法 1.1 材料 大鼠视网膜Müller 细胞株（rMC-1）由武汉大学生命与科学学院馈赠；花色苷（美国 Sigma 公司），GFAP 抗体（美国Sigma 公司），Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司），Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM，美国Hyclone 公司），胎牛血清（美国Hyclone 公司），0.25% 55 胰蛋白酶（美国Gibico 公司）。37℃、5％CO2 培养箱（美国Thermo 公司），倒置显微镜 （日本Olympus 公司），PCR 基因扩增仪、凝胶电泳仪及电泳槽、凝胶成像分析系统（美 国Bio-Rad 公司）。 1.2 视网膜Müller 细胞的体外培养及鉴定 体外培养视网膜Müller 细胞，采用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学染色方法 60 对细胞进行鉴定，具体方法如下：在6 孔培养板中预置盖玻片，待细胞生长接近融合时取出, 用PBS 液清洗，4%多聚甲醛固定60min。0.3%H2O2 阻断内源性过氧化物酶30min，蒸馏水 洗2min×2 次,滴加5%BSA封片20min,甩去液体不洗。加兔抗鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP, 稀释度1:100)，阴性对照组加PBS (0.01 mol/L，pH7.2) 。4℃保湿过夜，PBS 漂洗5min×3 次，分别加生物素化羊抗兔IgG, 20-37℃ 20min，PBS 洗2min×3 次。滴加SABC，20-37℃ 65 20min，PBS 洗5min×4 次，DAB 试剂盒显色，取1ml 双蒸水加A，B，C 各1 滴混合后加 至玻片，室温显色5-30min，双蒸水冲洗，苏木素轻度复染，以细胞浆内出现棕黄色丝网状 或颗粒状物质为阳性。 1.3 实验分组 将实验分为正常对照组（A 组）、高糖对照组（B 组）、高糖＋30 μmol/L 花色苷组（C 70 组）、高糖＋60 μmol/L 花色苷组（D 组）、高糖＋100 μmol/L 花色苷组（E 组）进行。 1.4 Müller 细胞高糖模型制作及实验检测方法 根据预实验结果，选择浓度为30 mmol/L 的葡萄糖并作用4 d 模拟高糖环境进行实验[10]。 采用0.25%胰蛋白酶消化基本贴满培养瓶底的Müller 细胞，制成细胞悬液，以密度1×106 个/孔细胞接种于6 孔板中。贴壁后，各组分别加入相应处理条件，置于37℃、5% CO2 培 75 养箱中培养。直接在六孔板中加入Trizol 试剂裂解细胞后，按照说明书提取总RNA，采用 紫外分光光度计测定RNA 纯度[吸光度（A，旧称光密度OD）260/A280 比值>1.8]，变性琼 脂糖凝胶电泳检测RNA 质量，将RNA 逆转录为cDNA，采用PCR 仪进行PCR 检测。反应 条件：95℃，30s；64℃，40s；72℃，40s；30 个PCR 循环，最后72℃延伸5min，内参照 采用GAPDH。应用引物设计软件Primer5.0 设计引物，并由上海英俊生物技术有限公司合 成：GLAST:上游：5’-GGGTTTTCATTGGAGGGTTGC-80 3’，下游：5’-CCACGGGTTTCTCT GGTTCAT-3’；GAPDH，上游：5’-CAAGGTCATCCATGACAA CTTTG-3’，下游5’- GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；PCR 产物定量分析：样品中待测基因的相对表达量 定义为目的基因cDNA 拷贝数与同一样品中GAPDH 拷贝数的比值。 1.5 统计学处理 85 采用SPSS17.0Windows 软件系统进行统计分析。所有数据以均数±标准差（ x ±s）表示， 采用单因素方差分析（Oneway-ANOVA），组间两两比较用LSD 检验进行显著性分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。 图1 Müller 细胞光学显微镜像×100，可见细胞呈长梭形，细胞浆丰富，细胞核位于细胞体中央 90 Fig.1 Müller cells under light microscopy (×100) 图2 Müller 细胞GFAP 免疫细胞化学染色像×100，细胞浆内可见棕黄色丝网状结构 Fig.2 Müller cells GFAP immunocytochemical staining (×100) 95 图3 不同浓度花色苷对高糖培养Müller 细胞GLAST mRNA 表达的影响 注：A：正常对照组；B：高糖模型组；C：高糖+30μmol/L 花色苷组；D：高糖+60μmol/L 花色苷组；E： 高糖+100μmol/L 花色苷组。 100 Fig.3 Expression of GLAST mRNA in high glucose cultured Müller cells after treated by cyain determined by RT-PCR Note: A: Control group; B: High glucose group; C: High glucose+30 μmol/L cyanin group; D: High glucose+ 60 μmol/L cyanin group; E: High glucose+100μmol/L cyanin group; 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1 2 3 4 5 不同的干扰因素 相对灰度值 GLASTmRNA的表达 图4 不同浓度105 花色苷对高糖培养Müller 细胞GLAST mRNA 表达的影响 注：1：正常对照组；2：高糖模型组；3：高糖+30μmol/L 花色苷组；4：高糖+60μmol/L 花色苷组；5： 高糖+100μmol/L 花色苷组。 Fig. 4 Expression of GLAST mRNA in high glucose cultured Müller cells after treated by cyain determined by RT-PCR 110 Note: 1: Control group; 2: High glucose group; 3: High glucose+30 μmol/L cyanin group; 4: High glucose+ 60 μmol/L cyanin group; 5: High glucose+100μmol/L cyanin group; 2 结果 2.1 视网膜Müller 细胞的培养及鉴定 光学显微镜观察发现，培养的Müller 细胞呈星形、长梭形、多角形等多种形态，细胞 115 轴突及树突较长，胞浆丰富，核膜清晰，细胞核呈椭圆形多位于细胞体中央（图1）。GFAP 免疫细胞化学染色发现，90%以上细胞GFAP 抗体染色阳性，表现为细胞浆内出现棕黄色丝 网状或颗粒状物质（图2）。 2.2 不同浓度花色苷对高糖培养Müller 细胞GLAST mRNA 表达的影响 496bp 处可见内参GAPDH 的表达条带，572bp 处可见不同信号的GLAST mRNA 表达 120 条带，且随花色苷浓度的增加，条带越明显，浓度为60μmol/L 时所得条带最亮最清楚（图 3）。与A 组相比，B 组视网膜Müller 细胞GLAST mRNA 的表达显著降低，差异有统计学 意义（P<0.05）。经不同浓度的花色苷处理后，视网膜Müller 细胞GLAST mRNA 的表达 上调，且花色苷浓度为60μmol/L 时，GLAST mRNA 的相对表达量最大（0.2275±0.0218）， 此后当花色苷浓度继续增加为100μmol/L 时，视网膜Müller 细胞GLAST mRNA 的相对表 125 达量反而下降（0.0940±0.0095）。各组间GLAST mRNA 相对表达量灰度扫描值差异均具有 统计学意义（P<0.05）。 3 讨论 谷氨酸是视网膜中一种重要的兴奋性神经递质，但过多的谷氨酸在突触和细胞间隙的积 聚会导致神经细胞死亡，有研究表明，5μmol/L 的谷氨酸便对神经细胞有致死作用[11]。谷氨 130 酸不会在突触间隙自动降解，主要由神经元突触前膜特别是神经胶质细胞的谷氨酸转运体来 摄取转运，而视网膜内的主要转运体是GLAST 并且主要表达在Müller 细胞的细胞膜上 [12-15]。Müller 细胞通过GLAST 摄取细胞外过多的谷氨酸，通过谷氨酰胺合成酶（GS） 将摄取的谷氨酸转变成谷氨酰胺，再转运至神经末梢；经过谷氨酰胺酶脱氨成谷氨酸 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写MBA论文 |
