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高频重复经颅磁刺激对脑梗死后学习记忆 功能及pCREB、bcl-2、bax 表达的影响# 赵秀秀1，韩肖华1，张靖慧1,2，黄晓琳1** 基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20090142110013）；国家自然科学基金（81071601）； 国家自然科学基金（81171858） 作者简介：赵秀秀，(1986-)，女，硕士，主要研究方向：脑卒中的康复。 通信联系人：黄晓琳，女，教授，博士生导师。E-mail: xiaolinh2006@yahoo.com.cn 5 （1. 华中科技大学同济医学院附属同济医院康复医学科，武汉 430030； 2. 中山大学附属第三医院康复医学科，广州 510630） 摘要：目的：研究高频重复经颅磁刺激对脑梗死大鼠学习记忆的影响，并探讨其可能机制。 方法：采用大脑中动脉阻塞再灌注方法建立脑梗死模型，给予7 天的20Hz 重复经颅磁刺激 治疗，采用Morris 水迷宫评定大鼠学习记忆功能变化，并观察磁刺激组与模型组、给予阻 10 滞剂与不给予阻滞剂组间pCREB、bcl-2、bax 的表达变化。结果：①模型组大鼠与正常组 相比逃避潜伏期明显延长（p=0.001），磁刺激组逃避潜伏期较模型组大鼠明显缩短（p=0. 017）。②磁刺激组的pCREB 和bcl-2 表达较模型组增加（P<0.01），bax 则较模型组减少 （P<0.01），bcl-2 与bax 的比值磁刺激组大于模型组（P<0.01）。rTMS+H89 组的pCREB 和bcl-2 表达较rTMS+NS 组降低（P<0.01），bax 的表达则较rTMS+NS 组增加（P<0.01）， 15 rTMS+H89 组bcl-2 与bax 的比值较rTMS+NS 组亦降低（P<0.05）。结论：高频重复经颅磁 刺激能够促进脑缺血后海马神经元的存活，抑制凋亡；磁刺激促进脑缺血后海马神经元的存 活的作用可能通过影响PKA-CREB 通路的表达来实现. 关键词：脑梗死；重复经颅磁刺激；学习记忆；蛋白激酶A-cAMP 反应元件结合蛋白；凋 亡 20 中图分类号：R49; R743 Effects of high-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation（rTMS）on learning and memory of rats with cerebral infarcti 25 ZHAO Xiuxiu1, HAN Xiaohua1, ZHANG Jinghui1,2, HUANG Xiaolin1 (1. Department of Rehabilitation Medicine, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, WuHan 430030; 2. Department of Rehabilitation Medicine, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, GuangZhou 510630) 30 Abstract: Objective: To investigate the effects of high-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) on learning and memory ability and its mechanism in rats with cerebral infarction Method: Reperfusion model with middle cerebral artery occlusion was established. Repetitive transcranial magnetic stimulation of 20Hz was given to successful models for 7 days. Learning and memory changes of the rats were observed with the Morris water maze. Expression 35 changes of pCREB, bcl-2 and bax were investigated between model control group and rTMS group or blocker injecting group and normal saline injecting group.Result: ①The escape latency in model control group delayed obviously as compared with that in blank control group(p=0.001). The escape latency in rTMS group decreased significantly as compared with that in model control group (p = 0. 017). ②The pCREB and bcl-2 expression increased in the rTMS group as compared 40 with that in the model group (P <0.01) . The bax expression decreased in the rTMS group compared with that in the model group (P <0.01). The ratio of bcl-2 and bax (bcl-2/bax) in the rTMS group increased compared with that in the model group (P <0.01). The pCREB and bcl-2 expression in the blocker injecting group decreased as compared with that in the normal saline injecting group(P <0.01). The bax expression increased in the blocker injecting group compared to 45 that in the normal saline injecting group (P <0.01). The ratio of bcl-2 and bax (bcl-2/bax) in the blocker injecting group fell compared with that in the normal saline injecting group (P <0.05). Conclusion: Repetitive transcranial magnetic stimulation of 20Hz could promote hippocampus neuronal survival after cerebral ischemic and inhibit apoptosis, which was probably realized by its affecting on the pathway of PKA-CREB. Keywords: cerebral infarction; repetitive transcranial magnetic stimulation; 50 learning and memory; PKA-CREB; apoptosis 0 引言 脑缺血引起的学习记忆功能损害是神经病学和康复医学领域常见的功能障碍，直接影响 55 到患者的康复治疗效果和生存质量。脑缺血会导致海马神经元死亡，而海马是学习记忆的关 键部位。PKA-CREB 信号转导通路能促进神经细胞的存活、再生、分化等，与突触的可塑 性和学习记忆功能有着密切的关系[1]，研究发现急性脑缺血激活了内源性保护机制 PKA-CREB 信号转导通路[2]。重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation， rTMS）是一种现代无创、无痛临床证明又安全的新技术，近年来，人们发现磁刺激还可以 60 改善存在记忆功能障碍老年人的记忆[3]和提高慢性中风患者的运动学习技能[4]。本研究应用 Morris 水迷宫观察高频rTMS 在改善脑缺血引起的学习记忆功能损害的作用并探讨其可能的 机制。 1 材料与方法 1.1 验动物分组 65 健康成年雄性SD 大鼠62 只，SPF 级，体重（250±20）g，购自湖南斯莱克景达实验 动物有限公司［ 许可证号：SCXK(湘)2009-0004］。实验动物分为两部分，第一部分30 只， 只参与Morris 水迷宫实验，随机分为正常组、模型组和rTMS 组，其中正常组6 只，模型 组和rTMS 组各12 只；第二部分32 只，不参与Morris 水迷宫实验，进行Western Blot 和免 疫组化检测，随机分为模型组、rTMS 组、rTMS+H89 组和rTMS+NS 组，每组8 只。 70 1.2 验动物模型的建立 1.2.1 侧脑室注射 rTMS+H89 组和rTMS+NS组大鼠称重后, 腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉, 在头顶 局部常规备皮、消毒, 头顶正中矢状切开约1cm, 3%H2O2 棉球擦拭使前囟暴露清晰，于前囟 后0.8 mm、前囟所在矢状线右侧1.5 mm 处用自制钻钻一小孔。用微量注射器取2g/L 的H89 75 或生理盐水10ul 进针至硬膜下约4.5mm, 缓慢脉冲式注入,分2～3 次完成， 每只约为5min。 注射完毕后留针10 min, 再缓慢退针, 以防药物沿针道返流。术后局部涂抹青霉素粉末,缝合 消毒皮肤预防感染。侧脑室注射完成后，立即进行大脑中动脉缺血再灌注模型的制作。 1.2.2 大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血再灌注模型的 建立 80 参照Takano 等[5]的方法线栓法制备模型：将大鼠颈部正中切开，长约1cm，暴露右侧 颈总动脉和颈外动脉，丝线结扎颈外动脉。分离颈总动脉，在距颈总动脉分叉处近端0.5cm 处结扎颈总动脉，在结扎线的远端置丝线备用。用微小动脉夹夹闭颈内动脉，在备用线的近 端用眼科剪剪口，将前端涂有牙胶的尼龙线线栓插进切口，至动脉夹处，稍系紧备用线，后 松开动脉夹，将线栓沿颈总动脉、颈内动脉顺行向上插入至大脑中动脉起始部，遇阻力时停 85 止，从颈总动脉分叉处计算插入深度为(1.9±0.1)cm，造成大脑中动脉供血阻断，60min 后 将线栓拔出，结扎丝线，缝合伤口，消毒皮肤，完成脑缺血再灌注模型。正常组不作任何处 理。观察大鼠清醒后行为学改变。采用Bederson 评分方法，将2、3、4 分动物纳入本实验。 1.3 复经颅磁刺激 YRDCCY-Ⅰ型磁刺激仪（武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司生产），圆形刺激线圈， 90 直径为60mm，脉冲磁场峰值强度为3.5T。模型制作第1 天实验组大鼠清醒状态下置于自制 固定器中，圆形线圈磁场边缘置于大鼠梗死侧大脑上方，线圈边缘距离颅骨1cm，与头皮相 切。刺激参数参考严莉等[6]的研究，频率为20HZ，强度为33％最大输出强度，刺激脉冲持 续5s，间歇60s，每个序列100 个脉冲，共10 个序列，每天刺激一次，连续7 天。 1.4 orris 水迷宫实验 95 采用Morris 水迷宫（中国医学科学院生产）进行行为学检测。模型制作的第五天开始， 第一部分正常组、模型组和rTMS 组大鼠进行水迷宫实验，包括定向航行实验和空间探索实 验，共5 次，最后一次为检测，4 天内完成。圆形平台固定放置于第三象限中心，放入适量 水使平台低于水平面3cm。①定向航行实验：每次分别从3 个象限(除平台所在象限)的中点 将大鼠逐一面向池壁放入水中，设定大鼠在平台上停留3s 为找到平台，记录大鼠在水中寻 100 找并爬上平台的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在60s 内未找到平台，则将其引导至平台， 停留20s 以熟悉环境，此时逃避潜伏期记为60s。②空间探索实验：第4 天撤去平台，于第 1 象限入水点处将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠60s 内第一次穿过平台的搜索时间(逃避 潜伏期)。 1.5 白免疫印迹（Western Blot） 105 rTMS 治疗结束后模型组、rTMS 组、rTMS+H89 组、rTMS+NS 组各取大鼠4 只，麻醉 后处死，断头取梗死侧海马，裂解、匀浆，取上清液，蛋白定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、 电转移和膜封闭，封闭结束后分别用抗大鼠p-CREB、bcl-2 和bax 抗体溶液室温孵育。p-CREB 抗体购自Santa 公司, bcl-2 和bax 抗体购自CST 公司。 二抗孵育后显色、曝光、显影，以 Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其累积光密度值（integrated optical density， 110 IOD），以GAPDH 为内参照,求得比值，即相对光密度值,并计算bcl-2 与bax 的比值，进行 半定量分析。 1.6 疫组化 rTMS 治疗结束后模型组、rTMS 组、rTMS+H89 组、rTMS+NS 组各取大鼠4 只，灌注 多聚甲醛固定，断头取脑，常规梯度酒精脱水、石蜡包埋，5mm 厚连续冠状切片，在海马 115 互抱平面间隔3 张取1 张，每个脑组织取3 张，采用标准SP 法进行染色，DAB 显色，其中 pCREB 无苏木精复染，bcl-2、bax 复染，检测大鼠海马各区（CA1、CA3、DG）pCREB、 bcl-2、bax 蛋白表达情况。每张脑片各区随机选取2 个视野，采用HPIAS-1000 高清晰度彩 色病理图文分析系统测定免疫产物的累积光密度值（IOD）。 1.7 计学分析 120 采用SPSS17.0 统计软件，所得数据以均数±标准差（ .x±s）表示。水迷宫实验各组 比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；Western 和免疫组化检测两组间采 用独立样本t 检验，P <0.05 表示具有统计学意义。 2 结果 2.1 orris 水迷宫测试 125 对参与水迷宫实验的各组统计分析发现，与正常组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期明显 延长（p=0.001），磁刺激组与正常组相比则无统计学差异（p=0.096），而模型组较磁刺激 组的逃避潜伏期则明显延长（p=0. 017），见表1. 学术论文网Tag：代写论文 代写代发论文 论文发表 |
