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表1 重复经颅磁刺激对脑梗死大鼠 Morris水迷宫行为学的影响（.x±s） 130 空间探索实验 组别 n 逃避潜伏期（s） 正常组 6 19.35±12.62 模型组 12 49.76±13.27① 刺激组 12 33.13±19.46② 135 ①与正常组相比P <0.05；②与模型组相比P <0.05 2.2 estern Blot 检测结果 140 Western Blot 结果显示，模型组、rTMS 组、rTMS+H89 组和rTMS+NS 组各实验组均表 达一定量的pCREB、bcl-2、bax (图1)。 对无侧脑室注射过程的模型组和磁刺激组各蛋白相 对光密度值进行统计分析，见表2，磁刺激组的pCREB 和bcl-2 表达较模型组增加，bax 则 较模型组减少，且均有统计学意义，bcl-2 与bax 的比值（bcl-2/ bax）两组比较具有统计学 差异，磁刺激组大于模型组。 145 表2 模型组和磁刺激组海马pCREB、bcl-2、bax相对光密度值的比较（.x±s） 组别 n pCREB bcl-2 bax bcl2/bax 模型组 4 0.12±0.02 0.38±0.09 0.72±0.15 0.57±0.25 刺激组 4 0.37±0.05① 0.68±0.10① 0.21±0.03① 3.24±0.34① 150 ①与模型组相比P <0.01 对进行侧脑室注射的rTMS+H89 组和rTMS+NS 组各蛋白相对光密度值进行统计分析， 155 见表3。rTMS+H89 组的pCREB 和bcl-2 表达较rTMS+NS 组减少，bax 则较rTMS+NS 组增 加，且均有统计学意义，bcl-2 与bax 的比值（bcl-2/ bax）rTMS+H89 组较rTMS+NS 组小， 也具有统计学差异。 表3 rTMS+H89组和rTMS+NS组海马pCREB、bcl-2、bax相对光密度值的比较 （.x±s） 160 组别 n pCREB bcl-2 bax bcl2/bax rTMS+H89组 4 0.20±0.03① 0.20±0.03① 0.67±0.06① 0.29±0.02② rTMS+NS组 4 0.36±0.03 0.61±0.10 0.28±0.11 2.43±0.95 165 ①与rTMS+NS 组相比P <0.01；②与rTMS+NS 组相比P <0.05 170 bax bcl-2 pCREB 175 GAPDH a b c d a,模型组；b，rTMS组 c, rTMS+NS; d, rTMS+H89组 图1 各组大鼠海马Western Blot 检测结果 180 2.3 疫组化检测结果 免疫组织化学染色检测模型组、rTMS组、rTMS+H89 组和rTMS+NS组大鼠海马pCREB、 bcl-2、bax 蛋白在不同区域的表达（见图2 和图3），光镜下观察, 海马各区均可见阳性细 胞，pCREB 位于细胞核内，bcl-2 和bax 主要位于细胞浆和突起，各蛋白主要分布于锥体细 185 胞层和颗粒细胞层，齿状回区较密集，阳性均呈棕黄色。对无侧脑室注射过程的模型组与 rTMS组各蛋白在不同区域的累积光密度值进行统计分析，见表4。磁刺激组CA1 区的pCREB 表达较模型组增多，有统计学意义，bcl-2、bax 表达未见统计学差异；CA3 和DG 区pCREB、 bcl-2、bax 各蛋白表达比较均未见统计学差异。对进行侧 190 表4 免疫组化模型组和磁刺激组海马不同区域pCREB、bcl-2、bax累积光密度值的比较 （.x±s） ①与模型组相比P <0.01 脑室注射的rTMS+H89 组和rTMS+NS 组各蛋白不同区域的相对光密度值进行统计分 195 析，见表5。rTMS+H89 组的pCREB 蛋白在CA1、CA3 和DG 各区表达均较rTMS+NS 组 减少，有统计学差异；rTMS+H89 组的bcl-2 在DG 区表达比rTMS+NS 组减少，且表现出 统计学差异，在CA1 和CA3 区则无差异；两组的bax 在各区均无差异。 200 表5 免疫组化rTMS+H89组和rTMS+NS组海马不同区域pCREB、bcl-2、bax累积光密度值的比较（.x±s） ① 与rTMS+NS组相比P <0. 01 210 CA1 CA3 DG rTMS+NS组 rTMS+H89组 图2 rTMS+H89组和rTMS+NS组pCREB在海马表达（免疫组化，SP法，×400） 215 rTMS+H89组 rTMS+NS组 图3 rTMS+H89组和rTMS+NS组bcl-2在海马DG区表达（免疫组化，SP法，×400） 220 3 讨论 急性缺血性卒中后很多患者遗留学习记忆障碍[7], rTMS 有助于提高急性脑梗死患者的 学习记忆能力，改善神经功能缺损[8]，因此，重复经颅磁刺激可能是一种改善脑缺血患者学 习记忆障碍的有效方法。本研究采用Morris 水迷宫实验来观察学习记忆功能的改变, 结果发 现，模型组大鼠逃避潜伏期较正常组明显延长（P <0.05），经过磁刺激治疗的刺激组逃避 225 潜伏期较模型组则明显缩短，但未达到正常组水平（P <0.05），说明磁刺激可以有效改善 脑缺血大鼠的学习记忆功能。 海马与学习记忆关系密切，此区域是本研究的重点。海马神经元对缺血缺氧损伤较敏感， 研究者认为全脑缺血后海马锥体细胞发生的迟发性、选择性神经元损伤为迟发性神经元死亡 (delayed neuronal death, DND)[9]。近几年研究结果发现大脑中动脉闭塞( MCAO ) 局灶性脑缺 230 血也可伴海马区DND[10,11]。海马神经元的迟发性死亡表现为坏死与凋亡共存现象[12]，而且 以凋亡为主[13]。参与凋亡现象的主要调控基因包括Bcl-2 和Bax 基因, 而且细胞凋亡受bcl-2 与bax 比值（bcl-2/ bax）变化调节[14]。Bcl-2 基因有较弱的促进细胞周期和细胞增殖的能力, 其过度表达可特异性抑制细胞凋亡; 而Bax 基因的过度表达能促进细胞凋亡的发生, 并对 抗Bc-l 2 抑制细胞凋亡的作用[15]。bcl-2/ bax 比值高, 细胞存活率高; 比值低, 细胞凋亡率高 235 [14,16]。rTMS 可保护短暂脑缺血发作所诱导的迟发型神经元死亡[17]。因此，我们推测rTMS 也许可以通过调节海马区细胞凋亡来保护缺血后神经元进而改善大鼠的学习记忆功能。 CREB 是一种具有选择性特异结合cAMP 反应元件（cAMP response element，CRE）的 核蛋白, 磷酸化的CREB(pCREB)是其活化形式，CRE 则是广泛存在于真核生物许多基因启 动区的一段DNA 序列, 磷酸化的CREB 与靶基因的CRE 结合，调节位于其下游的大量基 240 因如即刻早基因( c-fos 等) 、bcl-2[18] 、脑源性神经营养因子( BDNF)基因[19]等的转录。CREB 的磷酸化还是形成突触LTP 及认知功能的必要条件，并能调节多种神经功能, 包括神经兴奋 性、发育和突触可塑性, 还参与主动性神经保护作用[20].CREB 分子是多种蛋白激酶的磷酸化 底物，在这些激酶中，依赖于环腺苷酸的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)是使其磷酸化激 活的主要蛋白激酶, H-89 则是一种PKA 抑制剂，可抑制CREB 的磷酸化，因此，本实验采 245 用Western Blot 和免疫组化检测rTMS 对脑梗死后海马区pCREB、bcl-2 和bax 的影响，并进 行侧脑室注射H-89，观察pCREB 被抑制后bcl-2 和bax 表达的变化，进而研究rTMS 可能的机 制。 实验Western Blot 检测发现，磁刺激组大鼠海马pCREB 与bcl-2 表达较模型组均明显增 加，而刺激组bax 的表达则较模型组下降，刺激组bcl-2 与bax 的比值（bcl-2/ bax）大于模 250 型组，说明rTMS 能够促进脑缺血后bcl-2 的表达，这与Gao 等[21,22]的研究结果一致，不同 的是本实验发现rTMS 对bax 也有影响，使其表达下降，这可能是因为所研究大脑部位不同。 与rTMS+NS 组相比rTMS+H89 组的pCREB、bcl-2 表达量下降，bax 则增多，bcl-2 与bax 的比值（bcl-2/ bax）rTMS+NS 组大于rTMS+H89 组，说明CREB 的磷酸化被抑制后，rTMS 促进bcl-2 抑制bax 表达的作用减弱。Western Blot 结果表明磁刺激能够促进脑缺血后海马神 255 经元的存活，抑制凋亡，而且磁刺激促进脑缺血后海马神经元的存活的作用是可以通过影响 PKA-CREB 通路的表达来实现。免疫组化结果显示，磁刺激组pCREB 在CA1 区表达较模 型组增加，CA3 和DG 区则无差异，模型组与磁刺激组的bcl-2 和bax 在CA1、CA3 及DG 各区表达均无差异；rTMS+H89 组pCREB 在CA1、CA3 及DG 各区表达均比rTMS+NS 组 减少，rTMS+H89 组bcl-2 在DG 区表达比rTMS+NS 组减少，在CA1 和CA3 区则无差异， 260 两组的bax 在各区的表达均无差异。这可能是因为海马CA1 区对缺血较敏感，而DG 区对 缺血较为耐受[23]。 综上，脑梗死后高频重复经颅磁刺激的早期干预可以改善学习记忆功能，而且有可能通 过影响pCREB 进而影响其下游凋亡蛋白的表达来起作用，由此可见脑缺血后早期重复经颅 磁刺激治疗也许是促进神经元存活保护学习记忆功能的一种有效措施， 但磁刺激的最佳干 265 预时间和持续时间、强度等仍需深入研究和优化。此外，本研究的后续部分将进一步探讨高 频重复经颅磁刺激在改善脑缺血后学习记忆功能中的作用机制，为临床提供理论依据。 学术论文网Tag：代写论文 代写代发论文 论文发表 |
