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抑制钠氢交换蛋白1 促进低氧诱导的K562 细胞分化# 金薇娜，王建，常国强，蔺亚妮，王立洪，李华文，高伟，李庆华，庞天翔 基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20091106110038），天津市自然科学基金 （09JCZDJC17300） 作者简介：金薇娜，（1983-），女，博士研究生，主要研究方向：肿瘤细胞生物学。 通信联系人：庞天翔，（1959-），男，教授，主要研究方向：肿瘤细胞生物学。E-mail: pang@ihcams.ac.cn 5 （中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院，实验血液学国家重点实验室， 天津 300020） 摘要：本文主要探讨低氧微环境对慢性粒细胞白血病细胞系K562 分化的影响，以及钠氢交 换蛋白1（NHE1）在该过程中的作用。利用低氧模拟物CoCl2 或于低氧（2% O2、5% CO2 和93% N2）环境中培养K562 细胞；应用激光共聚焦显微镜测定细胞内pH 值，瑞士染色观 10 察细胞形态，实时定量RT-PCR 检测基因表达，Western blot 技术检测MAPK 磷酸化水平的 改变。结果表明：与对照组相比，低氧培养的K562 细胞表现出成熟相关的形态学改变，并 伴随CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）的mRNA 水平上调。特异性NHE1 抑制剂Cariporide 预处理能够促进低氧诱导的K562 细胞分化。Cariporide 处理后K562 细胞的p38 和ERK5 蛋白激酶磷酸化水平显著增强。结论：低氧及低氧模拟物能够诱导K562 细胞系分化。抑制 15 NHE1 活性协同促进低氧诱导的K562 细胞分化，其机制可能是通过增强细胞内MAPK 蛋白 激酶磷酸化水平，从而促进分化。 关键词：NHE1；细胞内pH 值；低氧；分化；C/EBPα 0 引言 白血病是一类由基因突变导致的造血系统恶性肿瘤，可使增殖失调，分化受阻，以及造 45 血祖细胞生存延长[1]。研究发现CoCl2 模拟低氧环境和低氧孵箱培养能在体内外抑制急性髓 系白血病（AML）细胞浸润并诱导其分化[2-5]。以上研究揭示了白血病与低氧之间的关系， 但忽略了微环境对白血病发生发展的影响，如低氧条件下细胞内pH（Intracellular pH, pHi） 的改变对白血病发生发展的影响。钠氢交换蛋白（Na+/H+ exchanger, NHE1）是一类存在于 细胞膜表面的离子转运蛋白家族。它通过将细胞内H＋与胞外Na＋进行交换来调控细胞内pH 50 的动态平衡，影响细胞的体积，运动、分化和凋亡等，从而参与许多复杂的生理和病理过程 [6-8]。以此为基础，本研究以慢性粒细胞白血病细胞系K562 细胞为考察对象，意在探讨低氧 环境对K562 细胞分化的影响，以及NHE1 在其中所发挥的作用。 1 材料与方法 1.1 材料和试剂 55 K562 白血病细胞系由本实验室保存。胎牛血清及RPMI1640 培养液由Gibco 公司生产； BCECF-AM、Nigericin 及Cariporide 均购自Sigma 公司；抗磷酸化p38 (pTpY180/182)、抗 磷酸化ERK5 (pTpY218/220)、抗磷酸化ERK1/2 (pTpY185/187)及抗磷酸化JNK1-2/SAPK (pTpY183/185)单克隆抗体，及p38、ERK1/2、JNK、ERK5 抗体均为Santa Cruz 公司产品； 其余试剂均为市售分析纯。实时定量PCR 仪为ABI 公司产品，激光共聚焦显微镜为 LEICA 60 公司产品，光学显微镜为Olympus 公司产品，酶标仪为Bio-Rad 公司产品。 1.2 细胞培养 K562 细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640 培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度的条件 下培养，取对数生长期的细胞用于实验。将细胞置于CO2 细胞培养箱独立密闭小室，充入2 ％O2、5％CO2 和93％氮气混合气体，用测氧仪检测氧浓度，以常氧培养细胞为正常对照组。 65 1.3 细胞内 pH 值测定 制定标准曲线：用RPMI 1640 洗3 次细胞，加入终浓度为1 mg/L 的荧光染料 BCECF-AM，37°C 孵育30 分钟，清洗3 次后重新悬浮于高钾缓冲溶液（25 mM HEPES， 120−7.6 mM KC1，20-132.4 mM CholineCl，0.8 mM MgCl2，1.8 mM CaC12，5.5 mM Glucose）， 加入终浓度为1 mg/L 的nigericin，37°C 孵育10 分钟，使细胞内pH 值分别达到7.4、7.2、 70 7.0、6.8、6.6、6.4 及6.2， 随即用激光共聚焦显微镜以氩激光488 nm 激发细胞内BCECF， 检测相应细胞的530 nm 和640 nm 发射荧光，求出荧光比值，做出pH 值与荧光比值之间关 系的标准曲线。 细胞pHi 值测定：收集5×106 个/ml 细胞，用RPMI 1640 清洗3 次，加入终浓度为1 mg/L 的BCECF-AM，37°C 孵育30 分钟，RPMI 1640 清洗细胞3 次，上机检测，记录530 nm 和 75 640 nm 发射荧光，求出两者的比值（530nm/640nm）。通过标准曲线可以计算pHi 值。 1.4 实时定量RT-PCR 取对数生长期的细胞，低氧处理24 或48 小时后，离心收集细胞，依据 Trizol 试剂盒 (Invitrogen，USA)说明提取细胞总RNA，取2μg 总RNA 反转录合成cDNA，再采用SYBR Green 实时定量 PCR 方法进行扩增。实时定量 PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限 80 公司合成。NHE1 上游引物为5’- AGC CTT CAC CTC CCG ATT T-3’，下游引物为5’-TGG GAC TTG TGG GAG ATG T -3’ (扩增产物180 bp); C/EBPα 上游引物为5’-G GAC AAG AAC AGC AAC GAG-3’ ，下游引物为5’-TT GTC ACT GGT CAG CTC CA-3’ (扩增产物130 bp); 中性粒细胞胞浆因子1（NCF1）上游引物为5’-G CCC AAA GAT GGC AAG AG -3’ ，下游 引物为5’-GC CTC GCT TTG CTT TCA T -3’ (扩增产物124 bp); 血清粘蛋白1（ORM1） 上 游引物为5’- GGG CTG TCT GTC TAT GCT GA 85 -3’，下游引物为5’-CTC CTC CTG TTT CCT CTC CT-3’ (扩增产物114 bp); GAPDH 上游引物为5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3’ ， 下游引物为5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’ (扩增产物226 bp). PCR 循环参数为： 95℃ 10S，95℃ 5 S，60℃ 30S 共 40 个循环。阴性对照以三蒸水代替 SYBR Green Real-time PCR Master Mix 加入扩增体系，以GAPDH 基因作为内参照进行PCR。使用比较循环阈值 90 (Cycle threshold，Ct)值法计算目的基因的相对表达量。 1.5 蛋白免疫印记（Western blot） 收集细胞后用RIPA 裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，按每泳道30μg 蛋白进行8％ SDS-PAGE 凝胶电泳。半干法电转移至硝酸纤维素膜，用含5％脱脂奶的TBS 室温封闭1 小时，一抗（1:200 稀释）敷育过夜，二抗室温敷育1 小时,ECL 化学发光法显色， 95 凝胶成像仪对结果扫描，用Bandscan 图像分析软件计算光密度，以目的蛋白条带灰度值与 内参GAPDH 灰度值的比值作为相应目的蛋白的表达量指标。每个样本至少重复3 次。 1.6 细胞分化形态的观察 分别于各时间点收集试验组和对照组细胞，PBS 洗涤两次，离心涂片，瑞士染色，晾干 后光学显微镜观察细胞形态。每张涂片计数200 个细胞计算诱导分化率，早幼阶段一下细胞 100 判断为分化细胞，诱导分化率（％）＝（已分化细胞数/200）×100％。 1.7 统计分析 数据应用SPSS11.0 软件分析。所有实验数值描述为均值±标准差，样本之间的比较采用 T 检验，P＜0.05 认为有统计学意义，数据用Graphpad 统计软件分析。 2 结果 105 2.1 低氧环境对K562 细胞分化的影响 光镜结果显示，低氧培养K562 细胞6 天后，与对照相比，细胞体积减小，胞浆增多， 核/浆比例缩小，核仁减少或消失，染色质浓集（图1A）。低氧处理24 小时后，粒系分化 标志基因NCF1、ORM1 mRNA 表达较对照组显著上调，髓系相关转录因子C/EBPα mRNA 水平升高，差异有统计学意义（图1B，1C，P< 0.05）。由此可见，低氧能够诱导K562 细 110 胞向粒系分化。 图1 低氧环境对K562 细胞分化的影响 Fig. 1 The effect of CoCl2 and 2%O2 on K562 cell differentiation. Magnifications: 10×40. p < 0.05, significantly different from the cells untreated. 115 2.2 低氧诱导K562 细胞分化伴随pHi 改变 实时定量PCR 结果显示，与常氧对照组相比，低氧及低氧模拟物对NHE1 mRNA 的表 达未见显著影响（P＞0.05）。常氧培养的K562 细胞pHi 为7.17，低氧培养及CoCl2 处理的 细胞pHi 24 小时升高，分别为7.24（P=0.0354）及7.22 (P=0.0482)；48 小时恢复至正常值（P 120 ＞0.05）。 图2 低氧诱导K562 细胞分化伴随pHi 改变 Fig. 2 Determination of intracellular pH (pHi) in K562 cells under hypoxia. p < 0.05, significantly different from the cells untreated. 125 2.3 抑制NHE1 活性促进低氧诱导的K562 细胞分化 应用NHE1 特异性抑制剂Cariporide（20μM）预处理细胞后低氧培养24 小时，与未加 Cariporide 的细胞相比，K562 细胞pHi 下降（图2）。细胞形态学结果显示，试验组67％的 K562 细胞向粒系分化，胞核可见切迹、凹陷，部分呈肾形或不规则形（图3）。结果说明 130 抑制NHE1 活性能够协同促进低氧诱导的K562 细胞分化。实时定量PCR 结果显示， Cariporide 能够协同性增强低氧诱导的NCF1、ORM1 及C/EBPα mRNA 表达（图4） 图3 抑制NHE1 活性促进低氧诱导的K562 细胞分化 Fig. 3 The effect of cariporide on hypoxia-induced differentiation. The morphological features were shown in 135 micrographs by Wright’s stain. 图4 与分化相关基因表达 Fig. 4 Determination of differentiation-related gene expressions in K562 cells. p < 0.05, significantly different 140 from the cells untreated. 2.4 抑制NHE1 活性激活MAPK 通路 免疫印记结果显示，应用Cariporide 抑制NHE1 活性能够增强K562 细胞中p38MAPK 及ERK5 的磷酸化水平，差异有统计学意义（图5，P< 0.05）。而ERK1/2 和JNK 磷酸化水 145 平未见明显改变（P＞0.05）。 http://www.paper.edu.cn - 6 - 中国科技论文在线 图5 Cariporide 抑制NHE1 活性激活MAPK 通路 Fig. 5 The effect of cariporide on MAPKs activities in K562 cells. 150 3 讨论 造血是一个精细的调控过程，经历了从造血干细胞－多能组细胞－成熟血细胞的过程。 出生后，骨髓中不成熟的造血祖细胞逐渐发育为外周血终末分化成熟细胞。造血祖细胞中造 血基因间的协同合作实现了对造血过程的精细调节[9]。为了探索低氧对K562 细胞分化的诱 导效应，明确NHE1 蛋白在该过程中的作用，我们用低氧模拟药物CoCl2及2%低氧培养K562 155 细胞，通过分化指标的检测分析，发现细胞增殖受到抑制，并向中性粒细胞分化成熟。该结 果表明低氧微环境能够诱导K562 细胞系向粒系分化。 造血系统中许多重要的造血相关转录因子协同作用调节骨髓中未成熟的祖细胞分化成 外周血成熟细胞[10-13]。在多种白血病细胞中都鉴定出有转录因子先天或后天的异常，由此证 明它们在人类白血病发病机理中有重要作用[14]。其中C/EBPα 是重要的转录因子之一，在于 160 多种组织细胞中（包括肺、乳腺及皮肤等）扮演了肿瘤抑制因子的角色[15,16]，并在髓系造血 学术论文网Tag： |
