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雷帕霉素对乳腺癌细胞株MDA-MB-231 生长和凋亡的影响# 摘要：背景与目的： 探讨雷帕霉素（rapamycin，RAPA）在体外对乳腺癌细胞株MDA-MB-231 生长和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法： 选择人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 为研究 对象，经不同浓度的雷帕霉素处理后，MTT 实验检测肿瘤细胞的生长抑制率，流式细胞仪 检测细胞凋亡， Western 印迹法检测乳腺癌细胞中bcl-2、survivin 蛋白的表达。结果：雷 10 帕霉素可使乳腺癌细胞株MDA-MB-231 增殖受到抑制并发生明显凋亡，且随时间延长作用 越显著，经雷帕霉素作用后的乳腺癌细胞表达survivin、bcl-2 较用药前明显下降，差异有统 计学意义（P ＜0.05）。结论：雷帕霉素可显著抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231 的增殖和 凋亡，其机制可能与凋亡调控基因bcl-2、survivin 的表达水平变化有关。 关键词：雷帕霉素；乳腺癌；细胞凋亡 Effects of rapamycin on cell growth and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells Abstract: BACKGROUND& OBJECTIVE To investigate the effects of rapamycin on cell growth and apoptosis of breast cancer cells line MDA-MB-231, and to elucidate its possible molecular mechanism. METHODS Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and flow cytometry (FCM) were 25 used to study the effects of rapamycin induced apoptosis in breast cancer cells line MDA-MB-231. The expressions of bcl-2,and surviving were measured by Western blotting. RDSULTS The inhibitory rate and apoptosis rate of MDA-MB-231 cells treated with rapamycin were higher than those in the negative control group(P<0.05), and with concentration-dependent and time-dependent effects. The expression of survivin and bcl-2 of MDA-MB-231 cell declined 30 obviously than that before medication. CONCLUSIONS Rapamycin in combination with paclitaxel leads to a significant apoptosis of neoplasm cells by inhibiting the expression of bcl-2 and survivin. Keywords: Rapamycin; Breast cancer; Apoptosis 35 0 引言 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR) 信号通路与肿瘤的发 生、发展密切相关，并与肿瘤的血管生成、转移以及对化疗的耐药有关[1]。而雷帕霉素 （rapamycin, RAPA,商品名Sirolimus）是mTOR 的特异性抑制剂，它不仅是一种新型高效的 免疫抑制剂，而且具有抗肿瘤作用 [2,3]。近年来的研究显示，雷帕霉素及其类似物具有抗人 40 前列腺癌、肺小细胞癌、恶性胶质瘤细胞等的癌细胞增殖活性，诱导癌细胞凋亡的作用 [4]。 本研究探讨雷帕霉素rapamycin 在体外对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 生长的影响及其可 能的分钟机制，旨在为rapamycin 应用于乳腺癌的治疗提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料来源 45 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 由美国典型物种保藏中心引进, 由同济医院妇产科肿瘤 实验室传代培养。DMEM 培养基为Gibcol/BRL 公司产品；新鲜胎牛血清购自杭州四季清公 司；雷帕霉素rapamycin 为美国Calbiochem 公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT) ；二甲基亚 砜(DMSO)、胰酶、Hochest33258 荧光染料为美国Sigma 公司产品；；抗bcl-2 抗体（sc-492-G）、 抗survivin 抗体（sc-10811）、抗β- actin 抗体（sc-7210）和羊抗兔二抗（sc-2004）均购自 50 美国Santa Cruz 公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养：乳腺癌细胞系MDA-MB-231 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基,在 5%ＣＯ2、37℃饱和湿度条件下培养。细胞呈贴壁生长。 1.2.2 MTT 实验：乳腺癌细胞系MDA-MB-231 以5×103 个细胞/孔接种于96 孔板中，常 55 规培养24h，换实验用培养液。用DMSO 溶解Rapamycin， 调整浓度为100mmol/L，于实 验当日用DMEM 培养液稀释，使DMSO 浓度＜0.1%。实验组加入5、10、20 和40 nmol/L Rapamycin，以不加Rapamycin、加DMEM 培养液稀释的0.05%DMSO 为对照组，每组设3 个复孔。细胞继续培养24、48 和72h 后，加入MTT 溶液(5g/L)20μL，继续孵育4h，每孔 加入150μLDMSO，振荡10min， 用酶联免疫检测仪读取每孔的吸光度(Ａ)值(λ 实验=490nm， 60 λ 参考=630nm)，绘制细胞生长曲线。按公式：细胞的增殖抑制率＝[对照组A 值－实验组A 值]/对照组×100%。实验重复3 次,每次、每时段均设3 孔。 1.2.3 流式细胞仪测定MDA-MB-231 细胞的凋亡率：实验分组同上，细胞加Rapamycin 后继续培养24 和48h 后，用冷PBS 洗涤2 次，收集各组处理后的细胞，用冰预冷的75%乙 醇固定，PBS 洗涤、离心。加入含有10μg /ml PI 和0.1%RnaseA 的PBS 室温处理至少20 分 65 钟后检测。用SubG1 法分析凋亡细胞，测定凋亡率。 1.2.4 Western 印迹法检测Rapamycin 对MDA-MB-231 细胞凋亡相关蛋白表达的影响 MDA-MB-231 细胞用无血清培养液培养24h 后，实验组加40 nmol/LRapamycin， 对照组加 入用DMEM 培养液稀释的0.05%DMSO，收集继续培养24、48 和72h 后的细胞，加入150 μL 三去污细胞裂解液裂解细胞提取蛋白，蛋白定量后取20 μg 进行12%SDS-PAGE，将蛋白 70 质转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride, PVDF）膜上，用5％脱脂奶粉封闭后，分 别加入1∶100、1∶200、1∶500 稀释的抗bcl-2、survivin 和β- actin 抗体，4 ℃培育过夜， TBST 洗涤，再加1∶1 000 稀释的对应二抗，37 ℃培育1 h，TBST 洗涤2 次。加入电化学 发光试剂于暗室中自显影，用凝胶成像仪进行拍照记录并进行灰度分析。 1.3 统计学处理 75 所有数据以±t 表示，用SPSS11.0 统计包中的方差分析、t 检验进行统计学分析。 2 结果 2.1 Rapamycin 药物对MDA-MB-231 细胞生长的抑制作用 MTT 检测结果显示， 5、10、 20 和40nmol/LRapamycin 作用MDA-MB-231 细胞24、48 及72 h 后，随着Rapamycin 浓度 的增加和作用时间的延长，对细胞的生长抑制作用逐渐增强，各浓度在作用72 h 时的细胞 生长抑制率80 达最高，分别为33.76%、38.12%、64.90%和89.24%。见图1。 图1 MTT 检测Rapamycin 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞生长的抑制作用 Fig.1 Inhibitory effects of rapamycin on cell proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells detected by MTT assay 85 2.2 药物处理后乳腺癌凋亡率的改变 FCM 检测结果显示，5 、10 、20 和40 nmol/LRapamycin 作用MDA-MB-231 细胞24 及48h 后，随着Rapamycin 浓度的增加和作用 时间的延长，细胞的凋亡率逐渐增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。 90 图2 FCM检测Rapamycin 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡的影响 Fig.2 Effects of rapamycin on the apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry 2.3 应用Rapamycin 对乳腺癌细胞中凋亡调控蛋白bcl-2、survivin 表达的影响 Western 印迹法检测结果显示，与对照组比较，40nmol/L Rapamycin 作用MDA-MB-231 细胞24、48 95 和72h 后，随着作用时间的延长，具有抗凋亡作用的bcl-2、survivin 表达水平明显下降（P ＜0.05，图3）。 图3 Western 印迹法检测40nmol/L 作用后乳腺癌MDA-MB-231 细胞bcl-2 和survivin 蛋白的表达 Fig.3 Expressions of bcl-2 and surviving proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells after treatment with 100 40nmol/L rapamycin detected by Western blotting 3 讨论 mTOR 是针对mTOR 信号通路的小分子抑制剂，属于酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是细胞 生长、增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长、增生有关环节的调控，然而多种肿瘤 105 中可见mTOR 通路失调，其异常表达与肿瘤发生、转移、血管生成、化疗耐药及预后差有 关[5]。由于它在信号传导和细胞增殖中的重要作用，以抑制mTOR 为主要作用原理的 Rapamycin 成为新的抗肿瘤药物，并进入临床开发的早期阶段。 最近研究发现, 雷帕霉素及其衍生物CCI-779[6]、RAD001[7] 和AP-23573[8] 对包括乳腺 癌在内的多种肿瘤细胞具有广泛的抗肿瘤作用，这些药物都已经进入了临床试验阶段。 110 Rapamycin 可以特异性阻断mTOR 下游的p70s6k 与4E-BP-1 的信号通路，通过抑制mTOR 阻断关键mRNA 的翻译，干扰细胞周期蛋白和G1 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂在细胞 周期早期的平衡，最终导致细胞周期停滞和细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长[9]。更为重要的是， 多项研究已证实，抑制潜在的mTOR 通路可诱导强烈的抗血管增殖和血管新生作用[10]。因 此，以靶向药物雷帕霉素联合化疗药物有望改善乳腺癌的治疗和降低蒽环类药物的心脏、骨 115 髓等方面的不良反应。 化疗是目前乳腺癌治疗的主要手段，但其非特异性的毒副作用和耐药性增加了临床治疗 难度。本研究结果表明，Rapamycin 可明显降低肿瘤细胞的增殖速率，并诱导细胞凋亡，这 种抑制作用表现为良好的时间依赖性。因此，Rapamycin 作为mTOR 特异性抑制剂作用于 PI3K/Akt 信号转导通路中的分子靶点，可在相关肿瘤的治疗中发挥免疫抑制和抗肿瘤的双 120 重作用，这为Rapamycin 在乳腺癌临床化疗中的应用，开辟了新的途径。 本实验也对Rapamycin 引起乳腺癌细胞株凋亡的分子机制进行了初步探讨。本实验结果 显示，Rapamycin 可引起乳腺癌细胞株中bcl-2、survivin 基因表达的明显下降，提示Rapamycin 可能通过抑制凋亡抑制蛋白bcl-2、survivin 基因的表达起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究 表明，Rapamycin 抗肿瘤的内在机制很复杂，而bcl-2、survivin 作为其中的一个方面，与 125 mTOR 相关的PI3K/Akt 信号转导通路存在何种联系，Rapamycin 到底还通过什么途径引起 肿瘤细胞凋亡而起到抗肿瘤的作用，都是我们下一步拟探讨的问题。 [参考文献] (References) [1]. Sirolimus: its discovery，biological properties，and mechanismof action［J］． Transplant Proc，2003， 130 35( 3) : 7S-14S． [2]. STEPHAN S, DATTA K, WANG E, et al. Effectof rapamycin alone and in combination withantiangiogenesis therapy in an orthotopic modelof human pancreatic cancer [J]. Clin Cancer Res ,2004, 10 (20): 6993-7000 [3]. SHEN Y, WANG X, XIA W, et al. Antiproliferativeand overadditive effects of rapamycin andFTY720 in 135 pancreatic cancer cells in vitro [J].Transplant Proc, 2008, 40(5): 1727-1733 [4]. M. Hidalgo and E.K. Rowinsky, The rapamycin-sensitive signal transduction pathway as a target for cancer therapy. Oncogene 2000, 19: 6680–6686 [5]. Trinh XB，Tjalma WA，Vermeulen PB，et al． The VEGF pathway andthe AKT /mTOR/p70S6K1 signalling pathway in human epithelial ovariancancer［J］． Br J Cancer， 2009，100( 6) : 971-978 140 [6]. Perralba JM, DeGraffenried L, Friedrichs W, et al. Pharmacodynamicevaluation of CCI-779, an inhibitor of mTOR, in cancer patients [ J] . Clin Cancer Res, 2003, 9( 8) : 2887- 2892 [7]. Boulay A, Zumstein-Mecker S, Stephan C, et al. Antitumorefficacy of intermittent treatment Schedules with the rapamycinderivative RAD0011 correlates with prolongedinactivative of ribosomal protein S6 kinase 1 in peripheralblood mononuclear cells [J]. Cancer Res, 2004 , 64( 1) :252- 261 学术论文网Tag： |
