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中国科技论文在线 SIS 结合磁性纳米颗粒热疗小鼠结肠癌实验 研究# 尹燕鹰1，陈明清2，洪敏1，高长娥1，董坚1** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20105317110001） 作者简介：尹燕鹰，男，（1985-），汉族，硕士研究生，肿瘤热疗。 通信联系人：董坚，（1964-），女，主任医师，肿瘤的生物治疗。E-mail: dongjian18@yahoo.com 5 （1. 昆明医学院第一附属医院生物治疗中心，昆明 650032； 2. 昆明医学院第一附属医院肿瘤中心，昆明 650032） 摘要：目的 研究小肠黏膜下层（SIS Small intestinal submucosa）吸附磁性颗粒后在交 变磁场中的加热升温，及其作为热疗介质应用于小鼠结肠癌模型热疗的效果。方法 将磁性 纳米颗粒沉淀在SIS 上，手术植入，使其包裹肿瘤组织，交变磁场下升温至43℃，观察肿 10 瘤抑制率、小鼠生存期，病理检测肿瘤的凋亡及各个脏器。结果 在交变磁场下，磁性颗粒 升温迅速。热疗组瘤体积增长抑制显著，病理检测证实肿瘤组织部分凋亡，正常脏器无变化。 结论 磁流体热疗在热疗后，7 天内肿瘤生长受到抑制，之后抑制缓解生长加快；SIS 吸附磁 性纳米颗粒在交变磁场中产热，植入热疗后，瘤体积的生长受到抑制，热疗后20 内天，肿 瘤生长明显受抑制，之后瘤体增长抑制减弱。实验证明植入热疗可为肿瘤治疗提供一定的理 15 论基础。 关键词：SIS；磁性纳米颗粒；交变磁场；热疗；肿瘤 中图分类号：R73 0 引言 结肠癌是一种临床最常见的消化道恶性肿瘤之一，目前结肠癌的治疗手段有限，且结肠 癌患者多为老年患者，并发症多预后差[1]。传统的手术、放疗、化疗等治疗结肠癌都有一定 45 的不足。因此研究新的治疗方法具有重要意义。目前热疗在肿瘤中的应用越来越广，局部加 温治疗主要是通过超声、微波、射频来实现，这些加热技术普遍存在对肿瘤的靶向能力差， 易导致周围组织的温度升高和易损伤正常组织的缺点。磁靶向热疗（MTH）[2]是近年来发展 的一种肿瘤热疗新方法，即适形定位于肿瘤组织中的磁性介质在外部交变磁场感应下升温， 使局部快速形成靶向高热区，使肿瘤细胞受到打击，MTH 的治疗理念一经提出就引起了不 50 同学科的广泛关注，随着生物技术、纳米技术、材料科学等学科的发展，肿瘤MTH 取得了 突破性进展[3]。 结肠癌的磁热疗研究甚少，本文就结肠癌的磁热疗做了基础研究，将磁热疗应用在小鼠 皮下结肠癌模型上，观察治疗效果及安全性。旨为磁热疗结肠癌提供实验依据和理论基础。 1 材料 55 1.1 实验材料及主要设备 材料为DMSA@γ-Fe2O3 磁流体，浓度为7.8mg/ml 由东南大学生物材料与器件重点实 验提供。小肠黏膜下层（SIS）昆明医学院制备。主要设备为高频交变磁场（SP-15 深圳双 平电源公司），光纤测温仪，流式细胞仪（美国BD 公司）。 1.2 细胞株及实验动物 60 CT-26 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院，RPMI 1640 培养(15%胎牛血清)。 Balb/c 小鼠66 只，4-6 周龄，体重22-25g 购自中国人民解放军军事科学院动物中心，在东 南大学公共卫生学院SPF 动物实验室饲养。 2 实验方法 2.1 SIS、ct-26、磁性颗粒三者相互作用的研究 65 2.1.1 SIS 吸附磁颗粒 将无菌DMSA@γ-Fe2O3 磁流体50μl 滴到SIS 上，待其溶液蒸发后再次滴加50μl，滴 加20 次，最终将1ml DMSA@γ-Fe2O3 磁流体吸附在SIS 上。 2.1.2 SIS 及吸附了磁颗粒的SIS 对CT-26 生长的影响 将CT-26 细胞，制成细胞悬液，浓度为4×105 个/ml，按2×105 个/cm2，0.5ml 的细胞 70 悬液滴在1cm2 的SIS 和吸附了磁颗粒的SIS 上，培养5h 后，加培养基继续培养。24h 后将 SIS 放入新培养板中培养，培养4 天后，HE 染色。 2.1.3 CT-26 对DMSA@γ-Fe2O3 颗粒的吞噬 CT-26 细胞与DMSA@γ-Fe2O3颗粒(浓度为30μg/ml)共培养24h。普鲁士蓝染色法染铁， 镜下观察细胞对DMSA@γ-Fe2O3 的吞噬情况。 75 2.2 热疗材料升温研究 将7.8mg/ml 3.9mg/ml、1.95mg/ml 和0.952mg/ml 的DMSA@γ-Fe2O3，4 种浓度磁流体 置于中频交变磁场中加热。光纤测温仪测温，辐照时间20 min。 将吸附了磁颗粒的SIS 置于频率40KHz，电流320A 交变磁场下，光纤测温仪测温，辐 照时间20min。 80 2.3 细胞对温度的敏感性研究 将CT-26 细胞，放入37℃、41℃、43℃、45℃、47℃水浴中，1h 后，镜下观察，流式 细胞仪检测细胞周期。 2.4 建立小鼠皮下结肠癌模型及体内热疗 将浓度为1×107/ml 的CT-26 悬液0.2ml/只，接种于66 只4-6 周龄雌性小鼠右侧颈近前 85 腋下。成瘤后，小鼠用0.3%戊巴比妥钠，按60mg/Kg 腹腔麻醉后，放入频率为40KHZ 的 交变磁场加热器进行热疗，磁场频率40KHz，电流320A。记录瘤区中心、瘤旁和体温的温 度变化。每24h 热疗一次，热疗三次后观察各组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况并记录。 成瘤后随机分为六组：a SIS 植入热疗组（SIS 植入包裹瘤体后交变磁场加热）；b 磁流 体热疗组（瘤内注射0.3ml,7.8mg/ml 的磁流体交变磁场加热）；c SIS 对照组11 只（SIS 植 90 入瘤区将其包裹后不处理）；d 磁场对照组11 只（不植入SIS 交变磁场下暴露）；e 磁流体 对照组（瘤内注射0.3ml,7.8mg/ml 的不暴露在磁场下）；f 空白对照组11 只，（不做任何处 理）。植入的SIS 均吸附了7.8mg 磁颗粒。 2.5 热疗对小鼠模型的治疗效果 依肿瘤体积V=(a×b2×π)/6(a、b 分别是肿瘤的长径和短径)，计算肿瘤体积，依肿瘤 95 体积抑制率(%) = ( 1—实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)100%，计算肿瘤体积抑制率。 2.6 组织学观察 加热治疗后24h，对照组和实验组随机挑选1 只小鼠，颈椎脱位法处死，迅速取出瘤体 和心肝脾肺肾经10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片行HE 病理检查。 2.7 统计学处理 100 实验所得数据应用SPSS18 统计软件进行处理，方差分析检验，多组间比较采用单因素 方差分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。 3 结果 3.1 SIS、ct-26、磁性颗粒三者相互作用的研究 将1ml 浓度为7.8mg/ml 的Fe2O3 滴在SIS 上，将磁性颗粒全部吸附沉淀在SIS 上，SIS 105 成棕褐色。 SIS 及吸附了磁颗粒的SIS 对CT-26 生长的影响，HE 染色可见SIS 和吸附磁颗粒的SIS 上有细胞层，磁性颗粒吸附在SIS 上，对细胞生长无影响，见图1 a b c d 图1 HE 染色（400×） a 单独SIS；b 110 为SIS 吸附磁流体；c SIS 上CT-26 培养；d SIS、磁流体和细胞共 培养 CT-26对DMSA@γ-Fe2O3颗粒的吞噬 CT-26细胞与DMSA@γ-Fe2O3颗粒共培养24h。 普鲁士蓝染色法染铁，镜下观察发现，细胞内有氧化铁呈蓝色颗粒，空白对照组无蓝色颗粒 115 （见图2），证明CT-26 细胞对DMSA@γ-Fe2O3 颗粒有吞噬作用。 a b 图2 普鲁士蓝染色 a 空白对照组 b 实验组 3.2 磁性材料升温 120 7.8 mg/m、3.9 mg/ml、1.95 mg/ml 和0.952 mg/ml 四个浓度的DMSA@γ- Fe2O3，在频 率为40KHz，电流为320A 的交变磁场下加热，前10min 升温迅速，之后温度进入平台期， 分别升高了45℃、33℃、22℃、11℃。吸附磁颗粒的SIS 升高了34.7℃，见图3。 图3 磁性材料升温曲线 125 3.3 细胞对温度的敏感性研究 热处理1h 后光镜下观察CT-26 在37℃下，细胞无变化；41℃下，形态变圆，换培养基 后继续培养12h 后细胞回复正常状态；43℃下，细胞形态变圆，部分飘起，换培养基后继续 培养12h 后，细胞形态仍然保持圆形，漂浮细胞增多；45℃，细胞变圆，部分细胞漂浮，换 130 培养基后继续培养12h 后细胞形态变圆漂浮细胞量增加；47℃下，大部分细胞成片飘起，大 量细胞飘起，细胞为梭型，仍然贴壁的细胞极少，换培养基后继续培养12h 后细胞成片漂浮， 贴壁细胞极少，细胞死亡。 流式细胞仪检测细胞周期，细胞凋亡率43℃为4.3%,可出现DNA 含量明显低于G1 期 的亚G1 期细胞峰,即凋亡峰,而37℃凋亡率为0.2%,前者凋亡率明显高于后者。 135 3.4 小鼠模型的建立及热疗组升温情况 CT-26 细胞接种8 天长成长径为1-1.5cm 的皮下瘤。 热疗组小鼠在麻醉下，通过光纤测温，瘤中心温度在15min 内升温至43℃，并稳定在 43℃附近，瘤旁温度稳定在41℃附近，而小鼠体温稳定在24℃，没有升温现象。 140 图4 小鼠模型热疗测温曲线 3.5 各实验组小鼠生存时间及热疗对肿瘤体积和抑制率的影响 各组小鼠模型生存时间见表1，磁流体热疗组前7 天瘤体增长抑制明显，之后抑制减弱 47.7±7.28 天；SIS 热疗组，瘤体积增长受到抑制，观察66 天有8 只在36 至58 天死亡，2 145 只存活时间超过66 天，截止观察66 天，平均生存51.2±10.96 天。生长曲线，见图5。 表1 6 组动物肿瘤模型生存时间比较（x￣±s)）d（单因素方差） 组别 生存时间 空白对照组 24.2±5.31 磁场对照组 35±13.59 磁流体对照组 36.4±5.60 SIS 对照组 25.8±5.73 磁流体热疗组 47.7±7.28※ SIS 热疗组 51.2±10.96△ 注：SIS 热疗组与各对照组比较△p<0.05，磁流体热疗组与各对照组※p<0.05 150 记录皮下肿瘤长径短径，瘤体积V=(A×B2×π)/6 公式计算瘤体积，绘制瘤体积生长曲 线，见图5。计算肿瘤体积及体积抑制率，见表2。 图5 各组瘤体积生长曲线 160 165 表2 SIS 热疗对应各对照组的瘤体积抑制率 组别 第5 天瘤体积cm3 抑制率 第9 天瘤体积cm3 抑制率 第16 天瘤体积cm3 抑制率 第20 天瘤体积cm3 抑制率 第26 天瘤体积cm3 抑制率 第30 天瘤体积cm3 抑制率 SIS 热 疗组 1.26±0.91 2.29±1.85 6.26±4.42 8.77±6.33 13.29±9.00 13.50±9.11 磁流体 热疗组 1.69±0.48 25.44% 3.95±1.09 42.03% 11.83±1.07 47.08% 16.09±1.70△ 45.49% 24.21±2.04△ 45.11% 28.14±2.14△ 52.23% 磁流体 对照组 2.96±1.03△ 57.43% 6.29±1.41△ 63.59% 11.84±1.79 47.13% 18.58±2.60△ 52.80% 26.87±2.38△ 50.54% 30.81±2.64△ 56.18% 植入对 照组 2.67±0.98 52.81% 5.49±2.17△ 58.29% 13.70±2.84 学术论文网Tag： |
