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雌激素通过瘦素信号通路途径调节脂肪细 胞代谢生成# 李文娟，许良智，陈焱，牟丽，许文明，程萌，庄静，李婷婷，詹晶** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20100181110007）；自然科学基金（81070464） 作者简介：李文娟（1986-），女，在读博士，主要研究方向：妇产科生殖内分泌 通信联系人：许良智（1957-），女，教授，主要研究方向：妇产科生殖内分泌. E-mail: liangzxu@126.com 5 （四川大学华西第二医院，成都 610041） 摘要：目的：探讨雌激素是否是通过瘦素相关信号通路对女性形体改变产生影响。方法：二 月龄雌性SD 大鼠随机为去势组及假手术组，术后14 周收集生殖器周围脂肪、内脏脂肪和 皮下脂肪，并分别检测瘦素受体表达，同时通过17-β雌二醇及瘦素对脂肪细胞前体细胞 (MSCs)进行干预，检验瘦素受体亚型、瘦素表达及成脂分化的指标PPARγ的变化。结果： 10 通过对造模期间大鼠体重的每周监测，发现去势组体重增长及术后14 周Lee’s 指数均明显 高于假手术组(P<0.001)。瘦素受体在去势组的脂肪组织中表达显著增加，内脏脂肪中尤为明 显。体外实验显示，随着瘦素和雌激素浓度的增加，MSCs 上瘦素长形受体和短受体的表达 均随之下降；随雌激素浓度的增加，MSCs 中瘦素表达呈下降趋势，同时，MSCs 中PPAR γ表达也受到抑制。结论：在低雌激素的影响下，去势后大鼠发生类似绝经后女性样的形体 15 改变，高浓度雌激素可抑制大鼠间充质干细胞向脂肪细胞分化，雌激素对瘦素及瘦素受体的 影响可能是绝经后女性体型变化发生变化的原因。 关键词：妇产科学；雌激素；瘦素；瘦素受；脂肪；间充质干细胞 中图分类号：R339.6 20 Estrogen regulate adipocyte metabolism through leptin signaling pathway LI Wenjuan, XU Liangzhi, CHEN Yan, MU Li, XU Wenming, CHENG Meng, ZHUANG Jing, LI Tingting, ZHAN Jing (West China Second University Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041) 25 Abstract: Postmenopausal women often present obvious body composition changes under the absence of estrogen, including overweight, obesity and android-like body fat distribution, therefore poses serious threaten for women’s health. Although the intimate relationship between estrogen and body appearance have been noticed, mechanism remains unclear. We assumed that estrogen may regulate fat distribution through affecting leptin signal pathway, which has been 30 shown playing major role in energy homeostasis. To test this hypothesis, we randomized female SD rat into ovariectomy (OVX) and sham group, and then collected adipose tissue around genital, retroperitoneal and subcutaneous after 14 week. Leptin receptor expression in adipose tissue was measured by western blot. Results indicated that leptin receptor were significantly down-regulated in ovariectomy group, especially in fat around genital. Weight changes were observed every week, 35 repeated measures analysis of variance showed that OVX group has higher weight gain compared with sham group during the 3 month (P< 0.001), and so does the Lee’s index (P< 0.001), which were calculated at the end of the study. We further used mesenchymal stem cells (MSCs), the progenitor of Adipocytes as an in vitro model to figure out the effect of estrogen on leptin receptor expression. After MSCs were treated by increasingconcentration of 17-βestradiol and letpin 40 respectively, QPCR were used to test the mRNA expression of leptin receptor subtype, OBRb (long form) and OBRa (short form). Negative correlation was noticed between estrogen concentration and leptin receptor subtype expression. Similar tendency were also observed in leptin treatment group. Besides, the expression of leptin in MSCs was degrading accompaied with increasing concentration of estrogen, and PPARγ, the indicator of adipogenisis, was also supressed under treatment of estrogen. Estrogen may act on leptin receptor 45 expression to influence the body composition in postmenopausal women. And the similar molecular mechanism of estrogen and leptin shows that these two hormones probably have synergistic effects on energy metabolism. Key words: Gynecology; Estrogen; Leptin; Leptin receptor; Adipose; Mesenchymal stem cells 50 0 引言 体重增加、肥胖、男性样脂肪分布等一系列体型变化等是高血压、糖尿病、代谢综合征 等多种常见疾病的危险因素，对生命健康有显著影响，而围绝经期和绝经后女性伴随着雌激 素下降出现以上改变的比例较绝经前明显增加[1,2]。在60 岁之前，女性的体重指数（body mess 55 index，BMI）随年龄增加而逐渐上升，60-64 岁时BMI 的平均水平达到高峰，绝经后女性 的BMI 也与血清中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C） 存在显著相关性[3,4]。尽管雌激素对女性形体的影响已经引起了学者们的广泛关注，但具体 机制仍不清楚。 瘦素是由位于染色体7q31.3 区肥胖基因编码的一种蛋白类激素，主要由白色脂肪细胞 60 分泌，脂肪分布及代谢和调节能量稳态的重要激素，与能量及糖脂代谢密切相关，具有广泛 的生物学效应，肥胖人群多伴发高瘦素血症。间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC） 是脂肪细胞前体细胞，含有雌激素受体和瘦素受体，在特定条件下（如胰岛素、地塞米松、 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛等）可以定向分化为脂肪细胞。目前研究报道雌激素在 体外有促进间充质干细胞增殖的作用[5]，但对雌激素是否能影响MSC 向脂肪细胞的分化， 65 是否是通过瘦素系统引起绝经后妇女体型改变仍不清楚。为解决以上问题，本文章从动物模 型和体外实验两方面入手，对雌激素影响绝经后女性体型的机制进行研究分析。 1 材料与方法 1.1 动物模型建立 40 只2 月龄雌性Sprague Dawley （SD）大鼠及饲料均由四川省医院动物中心提供，大 70 鼠体重210.84 ± 7.32g，根据体重分层随机分为去势组（OVX）和假手术组（sham）。术后， 两组动物均在室温22-26°C，每天12 小时光照，固定消毒，通风良好的相同条件下喂养。 自由摄水摄食。由华西医科大学实验动物中心提供。喂养期间每周测量大鼠体重，14 周水 合氯醛麻醉后断颈法处死所有动物，收集大鼠血清、内脏脂肪（肾周）、生殖器周围脂肪和 皮下脂肪。 75 1.2 细胞体外培养及干预 选择体重180-220g 的2 月龄SD 雌性大鼠，水合氯醛麻醉后断颈法处死大鼠，在无菌条 件下分离出大鼠长骨（股骨和胫骨），除去骨表面附着的肌肉组织，暴露骨髓腔，用注射器 吸培养基（EMDM-LG 低糖，10%FBS，1%青链霉素）反复冲洗冲洗骨髓腔，以6*107/ml 为密度接种到60mm 培养皿中，37°C 、5%CO2、饱和湿度的孵箱（Thermo Electron Corporation 80 3110）培养。原代细胞培养48 小时候更换培养基，弃去培养基中未贴壁细胞，贴壁细胞每 三天更换一次培养基，细胞长至80%融合状态以0.25%胰酶1:2 传代。对培养的第1、2、3 代细胞分别进行带荧光标记的CD3-Alexa488/CD29-APC 和CD44-FITC/CD45-Alexa467 （biolegend）染色，采用流式细胞仪器（FACSCanto, Becton Dickinson）检测并用软件 FACSDiva Software (Becton Dickinson)对培养细胞的表面抗原进行鉴定分析。选择生长良好， 85 纯度满意（>80%）的第三代MSC 作为后续研究的细胞模型。MSC 体外培养添加17beta 雌 二醇（sigma）浓度为10-5 至 10-10M，瘦素（R&D）浓度为75ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml。 1.3 瘦素受体蛋白表达检测 研究采用western bolt 方法检测并比较不同脂肪组织中的OBRb 表达。PBS 洗培养基后， 在培养皿中加入含1:100PMSF 的PBS 并刮取培养细胞，1000rpm 4℃离心10min，弃上清取 90 沉淀。配RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂PIMIX 1:100 ，PMSF1:100）冰上裂解1 小时，期 间每10 分钟涡旋一次，之后超声裂解细胞，14000rpm 4℃离心20min。取上清，用BCA （Biored）法进行蛋白定量，每个样本上样总量为20ug。蛋白制品混匀在loading buffer 内， 95°C 变性5 分钟后上样，在十二烷基硫酸钠SDS 溶液中100V 电泳80 分钟，采用槽式湿 转法冰上80V*90 分钟将蛋白转至PVDF 膜(Millipore, Bedford, MA)上，室温5%封闭液中封 95 闭PVDF 膜一小时。封闭后PVDF 膜4°C 孵育一抗过夜（ObR 单克隆抗体1:1000 稀释, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA and GAPDH 单克隆抗体1:1000 稀释, Abcam, Inc.）。15 ml TBST 洗15 分钟*3 次后，加入合适稀释度辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（中杉生物）， 室温孵育2h，缓慢摇动。15 ml TBST 洗膜15 分钟*3 次后，化学发光法显色（millipore）， 胶片法曝光(kodak) 。胶片扫描后， 灰度值计算分析采用NIH 提供Image J 软件 100 (http://rsb.info.nih.gov/ij)。 1.4 瘦素、瘦素受体及脂肪分化指标mRNA 表达检测 研究采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测MSC 在雌激素和瘦素影响下OBRa、OBRb、 leptin 和PPARγ 表达。3 代MSC 体外进行试剂干预8 小时后，根据试剂厂家指南采用 Trizol reagent (Invitrogen, Grand Island, NY) 提取细胞总RNA。总RNA 采用分光光度计 (Thermo) 105 检测密度，并计算逆转录PCR (RT-PCR) 上样所需500ngRNA 体积，RT-PCR 试剂盒 (Takara, Tokyo, Japan) 将总RNA 在37℃下逆转录30 分钟为cDNA。为了解各个样本中目的基因的 表达水平，采用含5ul SSO Fast EvaGreen 反应超混液 (Bio-red, Hercules, CA)，1ul 2.5uM 上游引物，1ul 2.5uM 下游引物，3ul 稀释10 倍的cDNA 模板为体系。引物设计采用primer premier 5.0 (PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA) ，生工生物合成，各个引物序列， 110 产物长度，退火温度及扩增效率见table1。混合后体系在qPCR 反应仪(Bio-red)中扩增：伸 展 50°C *2 min， 变性95°C *2 min, 45 个循环扩增（变性 95°C * 15 sec 之后退火温度*30 sec）, 65°C 延伸5min， 95°C * 1 sec 后结束. 基因表达量结果采用qPCR 反应仪自带软件 CFX ManagerTM Software (Bio-red) 进行分析。 表1 定量PCR 引物序列 115 Tab 1. Gene-Specific Primers infromation for qPCR Analysis Gene primer Tm (°C) Product (bp) efficiency (%) OBRa Sense 5' TTGAAGGAAGGAAGCAAACC 3' anti- sense 5' CATCAAACCTACATTGTGACCA 3' 59 109 100.9 OBRb Sense 5' TCTGGAGCCTGAACCAGTTT 3' anti- sense 5' TGTGGAATCTGGAGTGGTCA 3' 59 117 105.7 Leptin Sense 5' CATGCTGGAAGACGCACTTA 3' anti- sense 5' GGCAAGACCCATCAGTAGGA 3' 57 146 104.6 PPARγ2 Sense 5' TCTCACAATGCCATCAGGTTT 3' anti- sense 5' TTTGGTCAGCGGGAAGG 3' 58 165 111.7 GAPDH Sense 5' TATCGGACGCCTGGTTAC 3' anti- sense 5' CTGTGCCGTTGAACTTGC 3' 59 138 102.4 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写MBA论文 |
