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1.5 统计分析 计量资料采用一 X ± SD 描述，两组检验方法采用Independent T-test，多组检验方法采用 one way ANOVA；计数资料采用chi-square test。造模后体重变化采用重复测量的方差分析。 以P<0.05 为差异有统计学意义。所有分析使用软件SPSS16.0。 120 2 结果 2.1 去势后动物模型建立 术后14 周，去势组血清FSH 50.23 ± 15.95 IU/L，雌二醇水平37.14 ± 8.56 pg/ml，假手术 组血清FSH 6.68 ± 5.55 IU/L，雌二醇水平58.94 ± 10.36 pg/ml。采用两样本t 检验分析后， 结果发现，去势组FSH 明显高于假手术组（P<0.001），而雌二醇水平显著低于假手术组 125 （P<0.01），去势模型建立可靠（图1）。 A B 图1 A 造模14 周后大鼠血清FSH ；B 造模14 周后大鼠血清E2 Fig. 1 serum FSH test 14 weeks after surgery of rat; serum E2 test 14 weeks after surgery of rat 130 2.2 去势后动物体重体型变化 根据体重将实验大鼠分层随机分为去势和假手术组，两组体重没有显著差异（OVX 211.25 ± 7.07 VS Sham 210.79 ± 7.92，P>0.05）。造模14 周期间，每周固定时间检测大鼠体 重水平，并计算每周体重较前一周增减量，处死前麻醉后测量大鼠身长并计算Lee’s 指数， 采用重复测量方差分析对两组体重改变情况进行分析，Lee’s 指数采用两样本t 检验分析。 135 结果显示，两组体重改变差异明显（P<0.001）（图2），造模后大鼠体重Lee’s 指数显著 增加（P<0.001）（图3）。 图2 术后大鼠每周体重改变 图3 术后14 周大鼠Lee’s 指数 Fig. 2 weight changes per week after surgery of rat Fig. 3 Lee’s index of SD rat 14 week after surgery 140 2.3 大鼠脂肪组织瘦素受体蛋白表达 造模14 周后，本研究对收集的两组内脏脂肪、生殖器周围脂肪和皮下脂肪分别进行 Western blot 检测OBRb 表达情况，以GAPDH 表达量为内参进行统计分析。图4 可见，在 内脏脂肪中，去势组瘦素长型受体（OBRb）的表达量显著高于假手术组（58.01% VS 10.65%， P= 0.0373）；在生殖器周围脂肪中，去势组OBRb 表达量也明显增加（115.22% VS 39.65%， 145 P= 0.0375），见图5 五；在皮下脂肪中，尽管OBRb 表达量在去势组高于假手术组，但差 异没有统计学意义（63.00% VS 15.77%P= 0.1173），见图6。 内脏脂肪组织OBRb 表达 Sham Sham Sham OVX OVX OVX 150 内脏脂肪组织GAPDH Sham Sham Sham OVX OVX OVX 图4 western blot 检测造模后内脏脂肪组织OBRb 表达 155 Fig. 4 OBRb expression in retroperitonea adipose tissue (tested by WB) 生殖器周围脂肪组织OBRb 表达 Sham Sham Sham OVX OVX OVX 160 生殖器周围脂肪组织GAPDH Sham Sham Sham OVX OVX OVX 图165 5 western blot 检测造模后生殖器周围脂肪组织OBRb 表达 Fig. 5 OBRb expression in reproductive adipose tissue (tested by WB) 皮下脂肪组织OBRb 表达 170 皮下脂肪组织GAPDH Sham Sham Sham OVX OVX OVX 175 图6 western blot 检测造模后皮下脂肪组织OBRb 表达 Fig. 6 OBRb expression in subcutaneous adipose tissue (tested by WB) 2.4 E2 和leptin 对MSC 上瘦素长型受体（OBRb）与短型受体（OBRa）的表 达情况 180 本研究采用了大鼠成骨全骨髓培养的方法获得原代MSCs，在消化传代过程中分离骨髓 中丰富的造血干细胞，一代细胞生长约6-7 天。培养的细胞通过流式细胞术及分化诱导液进 行鉴定。由于MSCs CD29 CD44 表达阳性CD45CD3 表达阴性，而造血干细胞则相反，本研 究引入以上四个检测指标通过流式细胞术对培养的细胞进行鉴定，结果显示第三代细胞中表 达CD29 阳性 CD3 阴性的细胞占80.2%。 185 采用qPCR 的方法检测对E2 和leptin 干预8 小时后MSCs 上各瘦素受体亚型的影响。 在不同浓度干预之后，OBRa 表达在两个药物各浓度组与control 组比较未见显著性差异， 但是可以看出OBRa 在两组均显示出了随药物浓度增加而下降的趋势（图7）。OBRb 表达 在letpin 75ng/ml、100ng/ml 及低浓度的E2 均显示出明显的上调作用，两个药物浓度对OBRb 的关系显示出与OBRa 同样的趋势（图8），以上结果说明leptin 与E2 对瘦素受体各个亚 190 型显示出同样趋势的调节效应。 A B 图7 A qPCR 检测不同浓度瘦素干预后OBRa 表达；B qPCR 检测不同浓度E2 干预后OBRa 表达 195 Fig.7 OBRa expression under treatment of leptin tested by qPCR; OBRa expression under treatment of E2 tested by qPCR 图8 A qPCR 检测不同浓度瘦素干预后OBRb 表达；B qPCR 检测不同浓度E2 干预后OBRb 表达 Fig.8 OBRb expression under treatment of leptin tested by qPCR; OBRb expression under treatment of E2 tested 200 by qPCR 2.5 E2 和leptin 对MSC 成脂分化的影响 采用qPCR 的方法检测不同浓度E2 对MSC 上成脂相关指标（瘦素和PPARγ2）表达量 的影响。在添加雌激素后，尽管没有剂量依赖性效应，MSCs 向成脂分化指标PPARγ2 在各 205 个浓度（除10-9M 外）均呈现出显著下降；而瘦素在MSC 表达均有增加，但与control 组比 较，仅E2 10-10M~10-8M 组对MSC 中瘦素表达有明显差异，在不同浓度干预之后，瘦素表达 在各组呈现随E2 浓度增加而下降的趋势，雌激素可能直接调节瘦素在MSC 中表达，阻止 MSC 向成脂分化（图9）。 210 图9 qPCR 检测不同浓度E2 干预后PPARγ2 和瘦素表达 Fig.9 expression of PPARγ2 and leptin under treatment of E2 tested by qPCR 3 讨论 目前，雌性SD 大鼠由于对激素有较高的敏感性，是模拟人绝经后状态的最常用动物模 型。在对造模后14 周对模型动物血清进行的E2 和FSH 检测的结果显示，与对照组相比， 215 去势组大鼠呈现明显的低雌激素、高FSH 水平的改变，卵巢去势动物模型建立成功，可用 于后续研究。 Lee’s 指数是校正身长后对动物体重体型进行评价的指标，在动物实验中广泛应用， 较单纯体质量测量能更客观反映大鼠体重水平。本研究结果显示，去势模型大鼠的Lee’s 指数显著增加，本研究结果显示，去势模型大鼠的Lee’s 指数显著增加，前期研究结果发 220 现大鼠术后体质量随时间增加，体质量以及术后体质量与手术前体质量差值在去势大鼠增加 和明显高于假手术组，但Lee’s 指数在两组间没有差异，可能与前期实验动物采用的wistar 大鼠对激素的敏感性不及SD 大鼠有关[6]。以往同类研究比较了大鼠去势组、假手术组和去 势后雌激素替代组的体重改变，尽管没有对大鼠身长进行校正，结果发现去势组的大鼠体重 明显高于其他两组，与本研究结果一致[7]。对大鼠的行为学研究中发现，大鼠去势后出现摄 225 食摄水增加，活动度减少的行为学改变，体重明显增长，腹腔脂肪量也较对照组增加[8]。瘦 素是直接作用于摄食中枢的重要激素，与男性大脑相比，女性对瘦素的敏感性更强，雌激素 添加后的大鼠的大脑对leptin 抑制食欲作用的敏感性更高，雌激素直接作用于大脑提高对瘦 素的敏感性，降低胰岛素敏感性改变体脂分布，说明雌激素作用于大脑提高leptin 敏感性并 且可以降低皮下脂肪与内脏脂肪的比值[9]。研究报道去势大鼠脑内瘦素受体mRNA 没有变 230 化，但对leptin 的敏感性下降[10,11]，而脑室注射leptin 可以阻断低雌激素诱发的肥胖及中枢 对瘦素抵抗的状态[12,13]。去势后大鼠雌激素下降伴发摄食行为的改变，可能与中枢瘦素水平 和信号传导通路的改变有重要联系[11]。 瘦素的生物学效应是通过游离形式的瘦素与细胞膜上的特异受体结合后发挥的。瘦素受 体属于I 类细胞因子受体家族，包括长型受体（OBRb）和短型受体（OBRa、OBRc、OBRd 235 和 OBRe）。目前认为能发挥生物学效应的受体为OBRb 和OBRa，其中长型受体细胞内 含304 个氨基酸组成的结构域，能进一步激活一系列细胞内信号传导分子，是瘦素进行信 号传递的主要受体[14]。OBRa 型受体可能是作为瘦素的转运蛋白，将外周的瘦素通过血脑 屏障转运至中枢，其胞浆内的短序列也可以与下游JAK 信号通路分子结合，发挥效应[15]。 在对去势后大鼠不同脂肪组织中OBRb 进行western blot 检测的结果显示，在低雌激 240 素的环境下，脂肪组织中OBRb 表达增加，在内脏脂肪和生殖器周围脂肪中的这种变化尤 为明显。在女性人群的调查结果显示，腹部内脏脂肪面积、内脏脂肪与皮下脂肪面积的比值、 腰围以及腰臀比与年龄增长正相关。校正BMI 后发现，与绝经前女性在绝经后女性中内脏 脂肪面积，内脏脂肪与皮下脂肪面积的比值均显著增高，而皮下脂肪面积减少[16-18]。在肥胖 的动物模型中，给予17beta 雌二醇治疗也显著降低了内脏脂肪含量[19]。动物实验也发现， 245 去势大鼠腹腔脂肪量较对照组明显增加[8]，以上研究成果均提示我们，内脏脂肪对雌激素下 降的敏感性可能高于皮下脂肪，绝经后女性出现的肥胖、体重指数的增加、腹型肥胖可能与 内脏脂肪这类激素敏感型脂肪的关系更为密切。 本研究以脂肪前体细胞间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）为模型，探讨 不同浓度雌激素和瘦素干预下对MSC 上瘦素受体表达的影响，结果显示OBRa 和OBRb 表 250 达在均显示出了随两个药物浓度增加而下降的趋势，OBRb 的变化尤为明显，瘦素与E2 对 瘦素受体各个亚型显示出同样趋势的调节效应。在去势大鼠研究显示，OBRb 在脂肪组织的 表达在E2 治疗后降低[20]，从另一个角度验证了我们的研究结果。 瘦素主要由脂肪细胞分泌，做为脂肪细胞的前体细胞，MSC 中瘦素表达量的增加标志 着MSC 向脂肪细胞分化的趋势越来越明显。在体外对MSC 加入不同浓度的雌激素后，检 255 测瘦素mRNA 表达水平，研究结果显示，随着雌激素浓度逐渐增加，瘦素表达量呈现出剂 量依赖性的下降，雌激素可能直接调节瘦素在MSC 中表达，阻止 MSCs 向成脂分化。此外， 我们检测了雌激素对过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gama, PPARγ2)的表达影响，PPAR 是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员， 其中PPARγ2 主要表达于脂肪组织，与脂肪细胞分化关系密切，是MSC 成脂肪分化的标志 260 性指标，研究结果显示，与control 相比，不同浓度雌激素均能明显降低PPARγ的表达。 其他动物研究也显示，去势后动物的肠系膜瘦素mRNA 水平提高[21]，据以上结果我们推测， 在绝经后妇女中，由于雌激素浓度降低，MSC 成脂分化趋势增强，从而导致生成脂肪细胞 数目增加，可能是绝经后妇女发生体重体型改变的原因之一。 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写MBA论文 |
