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钩藤碱微透析探针回收率测定及影响因素研究# 马博，孙桂波** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金 （200800231106） 作者简介：马博（1982-1）女，北京协和医学院博士后，主要从事中药药代动力学研究 通信联系人：孙桂波（1973-4）女，副研究员，主要研究方向：中药药理学. E-mail: sunguibo808@126.com （北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193） 5 摘要：目的：研究利用外标法测定钩藤碱微透析探针回收率，为进一步的体内微透析实验提供依据。方法：采用增量法和减量法考察浓度、流速对探针回收率的影响。结果：微透析探针回收率受流速影响较大，基本不受浓度影响，且体内回收率稳定性良好。结论：微透析技术可用于钩藤碱的体内药动学研究，反透析法可作为体内研究中钩藤碱探针回收率的测定方10 法。 关键词：微透析；钩藤碱；探针回收率 引言 微透析技术（Microdialysis，MD）是用于清醒自由活动或麻醉动物的体液或者是特定组织细胞间液进行微创、连续采样的新技术[1,2]。与其它取样技术相比较，微透析具有实时、在体、微创、高效等优点[3]。经过几十年的发展，微透析技术已广泛的应用于药动学30 ( pharmacokinetic, PK ) 、与药效学( pharmacodynamic, PD)以及药动-药效（PK-PD）研究，是目前研究活体药物组织分布、 药物组织穿透力及监测药物有效浓度的可靠方法[4]。钩藤碱（rhynchophylline，RHY）是一种主要的四环吲哚类生物碱，为中药钩藤中的主要活性成分[5]。钩藤作为传统中药已经有很长的应用历史，具有清热平肝、熄风定惊之功效，临床上常用于治疗高血压、癫痫、头痛等疾病。经现代药学研究发现钩藤碱也具有很强的抗高血压、35 抗心律失常、抗血栓、抗惊厥作用。为进一步利用微透析技术研究钩藤碱的体内药动学过程，本研究对钩藤碱的微透析探针回收率进行了考察。微透析探针回收率是微透析实验的关键环节，它关系到体内物质浓度的计算[6]，因此稳定可靠的微透析探针回收率是进行微透析实验 的前提，本实验即针对微透析探针植入体内后可能受到的影响因素进行了考察了，为进一步的体内试验提供稳定可靠的实验条件。 40 图1.钩藤碱结构式 Fig. 1. The stereochemical structure of RHY. 1.材料和试剂 1.1 药品和试剂 45 钩藤碱标准品，纯度﹥98%，购于上海融禾医药科技有限公司；卡马西平，购买于中国药品和生物制品研究所；色谱级乙腈，购买于美国Fisher公司，三乙胺、冰醋酸购买于北京化学试剂公司，分析纯。36%盐酸，北京鼎国生物科技有限公司。林格式液由147mM NaCl, 3mM KCl, 1mM MgCl2 and 1.3mM CaCl2 组成，用前0.22μm滤器过滤（Millipore公司，美国）。 50 1.2 仪器 HPLC系统由Waters2695自动进样器、Waters996-DAD检测器和反相C-18柱（250mm×4.6mm, ID 5μm ,默克，德国），预柱（费罗门，美国）组成。微透析系统由微量注射泵(CMA/400)、冷凝收集器(CMA/470)、微透析探针（CMA/20）和恒温加热垫(CMA/150)组成。微透析探针（AB, Stockholm, Sweden），透析膜有效长度为10mm、分子截留量为15kD。 55 2.实验方法 2.1液相条件： 流动相由乙腈-0.15%三乙胺水溶液的(65:35, v/v)组成，流速为1mL/min，柱温保持为25℃，样品温度保持为15℃。所有样品均加入相同体积（30ul）0.2μg/mL的卡马西平溶液作为内标物质，混匀待测。 检测波长243nm，进样量，10μL。 60 2.2 标准曲线 精密称取钩藤碱对照品5 mg，置于50 mL量瓶中，加入乙腈-水（50:50）溶解并稀释至 刻度，振摇既得浓度为0.1 mg/mL的标准品储备液，置于4℃冰箱中保存备用。取储备液并用林格式液将其稀释成为浓度为0.05，0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg/mL的标准工作液，从低浓度到高浓度依次进样，每个浓度进样2次，进样量10μL。以钩藤碱和内标物质的峰面积比为65 纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线。钩藤碱浓度以线性回归法计算得出。标准曲线的相关系数至少要达到0.995。最低检测限定义为信噪比为3，最低定量限测定为信噪比为10。 2.3精密度和准确度 取高、中、低不同浓度钩藤碱标准品溶液于1天内连续测定5次，计算日内精密度；样70 品连续测定5天，计算日间精密度。取高、中、低不同浓度的钩藤碱标准品溶液，各浓度分别配制5批样品，每批样品测定1次，经标准曲线计算样品浓度，并计算准确度。 2.4体外研究 2.4.1流速对探针回收率的影响 采用增量法和减量法研究不同流速对探针回收率的影响。增量法是将微透析探针浸入含75 钩藤碱10 μg/mL的林格式液中，以不同的流速（0.5, 1, 2, 3, 4 μL/min）灌注空白林格式液，待平衡后，收集透析液，每个样品30μL，待测。减量法是将微透析探针浸入空白林格式液中，以不同流速（0.5, 1, 2, 3, 4 μL/min）灌注钩藤碱/林格式液（10 μg/mL），待平衡后，收集透析液，每个样品30μL，待测。增量法(obverse dialysis, OD)探针回收率按公式（1）计算，减量法(reverse dialysis,RD)探针回收率按公式（2）计算。 80 RR(OD) (%) = CS / C0 × 100% (1) RR (RD) (%) = (C0 − CS)/ C0×100% (2) 其中，C0表示含药林格式液的初始浓度，CS表示透析液中测得的药物浓度。 2.4.2浓度对探针回收率的影响 采用增量法研究不同浓度的钩藤碱/林格式液对微透析探针回收率的影响。将微透析探85 针浸入含有钩藤碱（0.5,5,50 μg/mL）的林格式液中，以空白林格式液进行灌流，流速为2 μL/min，时间间隔为15 min，平衡30 min后，收集透析液，待测。按增量法公式计算（1）钩藤碱回收率。 2.4.3 探针回收率日内重现性考察 连续改变探针外部溶媒浓度(0,0.5,1,5,50 μg/mL)，由低浓度到高浓度依次更迭再返回90 到低浓度，依次进行4个循环。用空白林格式液进行灌注，流速为2 μL/min，取样时间间隔为15 min，为达到归零状态，对空白林格式灌流时，取2个样品。按增量法计算探针回收率，探针回收率的重现性以回收率变化来衡量察。 2.5 体内研究 2.5.1 血液微透析探针的植入 95 取SD大鼠（250±30g），乌拉坦（0.5 mg/kg）腹腔注射麻醉，将动物置于恒温控制器上，保持体温在37 ℃。仰位固定，右侧颈部剪毛备皮，切开颈部皮肤暴露颈外静脉，用引导针引导套管插入颈外静脉，再将血液微透析探针沿套管插入，移除套管，结扎固定探针。整个操作过程中灌流空白林格式液保持探针膜处于湿润状态。 2.5.2微透析探针体内稳定性研究 100 将手术成功的探针经导管连接到微透析装置，反透析法灌流钩藤碱/林格式液(2.5 μg/mL)，流速为2 μL/min，取样时间间隔为15 min，灌流平衡2 h后，开始取样，连续取样8 h。体内反透析法探针回收率按公式（2）计算。 2.6数据处理 本实验应用的统计学软件是Phoenix WinNonlin 6.1。其中，药代动力学参数应用非线105 性分析Kinetica ver 4.4.1 (Thermo Fisher Scientific Inc, Philadelphia, PA, USA)，统计计算应用SPSS软件version 16.0 (SPSS GmBH, Chicago, Ill)。 3. 实验结果： 3.1标准曲线、准确度和精密度 钩藤碱和内标物质有较高特异性，分离效果良好，且无杂峰干扰，相关色谱图见图1。110 钩藤碱校准曲线的浓度范围为0.05-50 μg/mL，标准曲线为y=3.1577 x +0.0573，具有良好的线性相关性(R2=0.9997)。钩藤碱的保留时间约为5.1min，内标（卡马西平）保留时间约为3.7min。。钩藤碱的最低定量限经测定为50 ng/mL，最低定量限经计算为15ng/mL。0.5，5，50μg/mL的钩藤碱标准溶液日内精密度RSD分别为1.51%，2.01%，1.26%，日间精密度RSD分别为2.17%，3.47%，3.23%，均小于5%，表明精密度良好。0.5，5，50 μg/mL的钩藤碱115 标准溶液的准确度分别为97.56%，100.36%，103.18%，标准偏差均小于5%，表明准确度良好。 图2：A为空白林格式液色谱图，B为钩藤碱色谱图(0.5μg/mL)；峰1，为内标物质卡马西平，峰2为120 钩藤碱的色谱峰。 Fig. 2 (A) Representative chromatograms of the blank blood dialysate sample; (B) a standard RHY solution (0.5 μg/mL) spiked into blank blood dialysate; (Peak 1) the internal standard: carbamazepine; (Peak 2) RHY. 3.2流速对探针回收率的影响 不同流速体外回收率的测定结果表明，钩藤碱的回收率随着流速的增加呈指数型降低，125 且增量法和减量法所测得的探针回收率在各流速条件下均基本一致，这为反透析法测定钩藤碱体内探针率提供了依据。结果见图2。体内微透析实验中，钩藤碱的体内药物浓度需要经过探针回收率进行折算，而体内探针回收率的测定只可能通过反透析法（减量法）实现，而体内药物测定是通过增量法进行的。因此，本实验测得增量法与减量法探针回收率基本一致，是体内利用反透析探针回收率计算体内药物浓度的基础。 130 图3增量法和减量法测定不同流速对探针回收率的影响 Fig. 3 The effect of different flow rates on the microdialysis probe recovery rate was assayed by increment method and decrement method. 135 3.3浓度对探针回收率的影响 应用增量法测定体外不同浓度钩藤碱对探针回收率的影响（见图2），浓度为5,10,20 μg/mL的钩藤碱/林格氏液，探针回收率分别为（29.51±1.25）%,（28.63±0.90）%,（29.06±0.90）%，结果可见浓度对探针回收率基本无影响，证明计算体内药物浓度时可用同一探针回收率进行计算。 140 图4 浓度对探针回收率的影响 Fig. 4 The effect of concentration on the microdialysis probe recovery rate. 3.4探针回收率的重现性 145 探针回收率重现性试验结果显示（见图4），在4个循环中，钩藤碱的探针回收率变化基本保持稳定，且存在相似的变化趋势。浓度为0.5,1 μg/mL的钩藤碱的回收率由于受导管内死体积的影响未达到平衡的回收率水平，但由于每次灌注的死体积量相等，因此呈现相似的回收率变化趋势。 150 图5 探针回收率的日内重现性 Fig. 5 The intra-day reproducibility of the microdialysis probe recovery rate. 3.5体内探针回收率的稳定性 体内探针回收率稳定性试验结果显示（见图5），实验测定了3支只探针的体内回收率，155 结果显示不同探针之间回收率的存在一定程度的差别；而每支探针体内平衡2h后，反透析法连续灌注体内回收率可持续稳定6小时，经统计3支探针的回收率分别为（36.02±1.98）%,（26.34±1.80）%,（15.77±2.09）%,RSD均小于3%。结果提示由于每支探针的回收率存在差别，因此有必要在每次微透析实验前进行探针回收率的测定。 160 图1 体内微透析探针回收率的稳定性 Fig. 1 The stability of the in vivo microdialysis probe recovery rate. 4. 讨论 微透析取样技术可以在无重大创伤、无人为干预，基本不影响动物生理学特征的情况下进行长时间的取样[7,8],在药物动力学及药效学研究中具有独特的优势。相对于其它取样技165 术 ,微透析技术具有以下几个方面的显著特点: （1）样品纯净：不含有蛋白质等大分子量的物质，免除了复杂的样品前处理，可以直接用于检测仪器的分析检测，减少了由样品处理产生的损失和误差。（2）样品稳定：透析膜对分子量的物质有截留作用，只有小分子物质可透过膜进入样品收集器，而大分子物质和能破坏目标物质的酶类则被排除在外，避免了透析液中化学物质的酶解作用。（3）取样时间长：一旦探针植入完成之后，就可以在没有其170 他的人为干预的情况下，从每个取样部位持续取样，取样时间可长达数天。（4）多位点同时取样：由于微透析技术对生物体的损伤程度微小，且基本不影响生物体的生理特征，因此可以进行多位点的同时检测，可同时观察药物对不同位点的影响。（5）作用靶点研究：探针可植入局部组织，是药物靶向性研究的重要手段。 在微透析实验中，探针回收率是将微透析技术应用于体内研究的一个关键问题。微透析175 探针回收率可受诸多因素影响，包括探针的性质（如膜的有效长度、膜的材质等）、灌流液的组成、待测物质的性质、流速、温度、PH值等诸多因素的影响[9]。微透析探针植入体内后，其回收率还受取样部位的生物物理性质、传质阻力、待测物质的分子量等生理因素的影响[10]。使用商品探针进行微透析实验时，透析膜的材质和结构已确定，因此实验中并未加以讨论。实验过程中对回收率影响较大的因素包括以下几个方面：（1）温度对微透析探针回180 收率有较大影响，一般可随温度的升高而升高。这是由于物质的扩散系数受温度的影响较大，一般温度每升高1度，扩散系数可增加1-2%[10]。微透析体内实验温度均控制为37℃,故本 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
