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三种秦艽药材提取物的抑菌作用研究# 赵 兵1，赵 婷1，高 昂1，倪士峰1，田怡涛2，陈千良1** 基金项目：教育部博士点新教师基金(20096101120013)；陕西省中医药管理局科研项目(zy56)；陕西省自然科学基金项目(SJ08-ZT02-4)；西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室开放基金(ZS11003) 作者简介：赵兵（1986-），男，硕士研究生，主要研究方向：中药资源 通信联系人：陈千良（1977-），男，博士，讲师，主要研究方向：中药资源与品质研究. E-mail: cql999999@126.com （1. 西北大学生命科学学院，西安，710069； 2. 甘肃农业大学农学院，兰州，730700） 5 摘要：采用试管稀释法和纸片扩散法研究三种秦艽药材水煎液和醇提物的体外抑菌作用。结果表明：三种秦艽药材水煎液对大肠杆菌均有一定抑制作用，并且水提物强于各自的醇提物，其中大叶秦艽最强，麻花秦艽最弱。三种秦艽药材水煎液和醇提物对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，而醇提物强于各自水提物，同样以大叶秦艽最强，麻花秦艽最弱；三种秦艽药材醇10 提物对枯草芽孢杆菌均有抑制作用，而水提物作用较弱。 关键词：中药药理学；抑菌作用；大叶秦艽；麻花秦艽；小秦艽 0 引言 秦艽始载于《神农本草经》，列为中品，具有祛风湿、清湿热、治痹痛之功效，是我国重要的传统中药。现代药理研究表明其具有抗炎、镇痛、调节免疫、保护肝损伤、抗菌、降血压和利尿消肿等作用[1]，广泛用于心脑血管疾病,呼吸道疾病,肝胆疾病,风湿、类风湿性关35 节炎等疾病的治疗[2,3]。2010年版《中国药典》规定的秦艽基源植物包括大叶秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）、粗茎秦艽（G. crassicaulis Duthie ex Burk.）、麻花秦艽（G. straminea Maxim.）和小秦艽（G. dahurica Fisch.）四种[4]。经权宜淑考证，位于黄土高原的陕西和甘肃两省为秦艽道地产区。陈千良等研究了陕西产秦艽中的化学成分，并测定了其甲醇提取液的指纹图谱，随后又从陕西产小秦艽中分离得到栎瘿酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷、40 龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷[5-7]。陈克克从陕西产秦艽中提取分离得到一种水溶性秦艽多糖，并采用HPLC分析了其多糖的单糖组成[8]。 文献对各种秦艽药材化学成分的研究较多，而其相关药理研究报道较少，本文以陕西产秦艽为主要研究对象，对大叶秦艽，小秦艽和麻花秦艽三种源药材的抑菌效果进行了初步研究，考察了其水提物及醇提物对常见致病菌的作用效果，测定了其抑菌圈大小及最低抑菌浓45 度（MIC）。为探讨三种秦艽药材药理作用和药效的异同，为秦艽药材临床应用得更加安全和有效提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验药材 50 陕西产小秦艽药材2010年购自河北安国药材市场，经北京中医药大学陈玉婷教授鉴定为龙胆科植物小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.）的干燥根。大叶秦艽药材采自西北大学陕西陇县秦艽种植基地，经西北大学生命科学学院魏朔南教授鉴定为大叶秦艽（G. macrophylla Pall.）的干燥根茎。麻花秦艽药材购自青海藏医院，经桑杰主任药师鉴定为麻花秦艽(Gentiana straminea Maxim.)的干燥根和根茎。 55 1.1.2 供试菌株 大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），以上菌种均为西北大学生命科学学院微生物实验室保存。 1.1.3 培养基 Mueller-Hinton肉汤（MHB）培养基（中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任60 公司），琼脂（青岛水产品加工厂） 1.2 仪器 SW-CJ-1F型无菌操作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），LDZX-50KBS型立式蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），ZHWY-2102C型摇床（Zhi Cheng），MH-2000型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司），1000μL、100μL移液器（日本立洋），KW-1型恒65 温培养箱（银川市金属制品厂）。 1.3 方法 1.3.1 水提液的制备 分别称取60℃恒温三种干燥的秦艽药材粗粉100g，加入500mL蒸馏水, 置煎煮锅中浸泡30min后加热煮沸2h，滤过。滤渣再加水500mL，煎煮1h，过滤，合并两次滤液，真空抽滤，70 浓缩至50mL（每毫升含生药水提取物2g），4℃冷藏备用。 1.3.2 醇提物的制备 分别称取60℃恒温干燥的三种秦艽药材粗粉100g，加入95%乙醇500mL，回流提取2h，滤过。滤渣再加95%乙醇500mL，回流提取1h，过滤后合并两次滤液，真空抽滤，所得滤液回收乙醇后,向浸膏中加入蒸馏水100mL和几滴吐温-80，制成混悬液（每毫升含生药醇提物75 1g），4℃冷藏备用。 1.3.3 培养基的制备 25 g肉汤培养基粉末加入1000mL蒸馏水，加热完全溶解为液体培养基。再向其中加入15 g琼脂粉，则制成固体培养基。在三支试管中各加入10 mL的培养基，其余的分装至三个1000 mL锥形瓶中，在103.43kPa，121℃下高温高压灭菌20 min。将三支装有肉汤培养基的80 试管倾斜放置，制成斜面，放置待水分挥发及凝固[9]。其它的培养基则倒平板备用。 1.3.4 菌悬液的制备 将受试菌在1.3.3中所制斜面培养基上活化2-3代，用接种环从斜面上刮取菌苔两环，分别收集到有100 mL无菌水的250 mL的锥形瓶中, 采用平板菌落计数法[10]，将受试菌配成终浓度为1×108个/mL的菌悬液，备用。 85 1.3.5 纸片扩散法 参照文献[11]方法，取浓度1×108个/mL的菌悬液0.1 mL将其均匀涂布于肉汤培养基平板表面，稍干后将经过灭菌吸并取了三种药材药液（药材水提液浓度为2 g/mL；醇提物浓度为1 g/mL）的圆滤纸片(直径6 mm，每片吸取药液10 μL)，贴于平板表面，每皿3片,每种菌平行两组。置37℃恒温箱培养24 h后观察测量抑菌圈直径，计算平均值。 90 1.3.6 最低抑菌浓度（MIC）实验 药物的最低抑菌浓度（MIC）的测定采用试管二倍稀释法[12]。取灭菌有棉塞试管6支，编号，每管先加入无菌肉汤培养基1.0 mL，然后于第1管中加入灭菌的受试中药水提物1.0 mL，混匀后取出1.0 mL放入第2管中，依次进行二倍稀释, 第5支试管混匀后吸取1.0 mL弃去, 使每支试管都含有1.0mL的不同稀释度药液，第6支试管中不添加药物为阴性空白对95 照，各管平行3 份。水煎液的浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625 g/mL；95%乙醇提物的浓度依次为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 g/mL。取浓度1×108个/mL的菌悬液0.1mL分别加入上述1- 6管中混匀，置恒温培养箱中培养24 h，观察结果。 2 结果 2.1抑菌圈大小的测定 100 三种秦艽药材不同提物对3种细菌的影响作用均不同，并存在一定的差异，而且同一药材对不同细菌的抑制效果也不同。由表1可知，三中秦艽药材水煎液对金黄色葡萄球菌有不同的程度的抑制作用，作用效果依次为大叶秦艽>小秦艽>麻花秦艽。大叶秦艽和麻花秦艽对枯草芽孢杆菌均无抑菌作用，而小秦艽对枯草芽孢杆菌具较弱的抑制作用。由表2可知，三种秦艽药材醇提物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用，作用效果105 依次为大叶秦>小秦艽>麻花秦艽。大叶秦艽和麻花秦艽醇提物对大肠杆菌均无抑制作用，小秦艽醇提物对大肠杆菌有相对较弱的抑菌作用。 表1秦艽药材水煎液抑菌圈大小 Tab.1 Size of inhibition zone of Gentiana decoctions 大叶秦艽 小秦艽 麻花秦艽 大肠杆菌 8.42±0.58 7.00±0.55 6.00±0.00 金黄色葡萄球菌 8.50±0.45 8.25±0.42 6.67±0.61 枯草芽孢杆菌 6.00±0.00 6.67±0.41 6.00±0.00 注：抑菌圈直径大于6mm为有抑菌作用，小于或等于均为无抑菌作用，浓度为2000 mg/mL 110 表2秦艽药材醇提物抑菌圈大小 Tab.2 Size of inhibition zone of 95% ethanol extracts from Gentiana 大叶秦艽 小秦艽 麻花秦艽 大肠杆菌 6.00±0.00 6.50±0.84 6.00±0.00 金黄色葡萄球菌 10.67±0.52 9.50±0.55 7.67±1.37 枯草芽孢杆菌 10.50±0.84 10.00±0.63 8.50±1.76 注：抑菌圈直径大于6mm为有抑菌作用，小于或等于均为无抑菌作用，浓度为1000 mg/mL 2.2最小抑菌浓度 秦艽不同提取物对各受试菌的抑菌效果呈一定的量效关系。在低浓度时，基本无抑菌活115 性，抑制环大小随着药液质量浓度的增加而增大，抑菌活性才逐渐显现出来，由此可判断三种秦艽药材不同提取物对不同细菌的最小抑菌浓度（MIC）。秦艽药材水煎液的初始浓度为2 g/mL，由表3知，大叶秦艽水煎液对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.25 g/mL；对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.5 g/mL；对枯草芽孢杆菌无抑制作用。由表4知，小秦艽水煎液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC值为0.5 g/mL；对金黄色葡萄球菌的MIC值为1 g/mL。120 由表5知，麻花秦水煎液艽对金黄色葡萄球菌的MIC值0.5 g/mL；对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用。 秦艽药材醇提物的初始浓度为1 g/mL。结果由表6知，大叶秦艽醇提物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值均为0.125 g/mL；对大肠杆菌无抑制作用。由表7知，小秦艽醇提物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC值均为0.25g/mL；对金黄色葡萄球菌的MIC值125 为0.125 g/mL。由表8知，麻花秦艽醇提物对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.125 g/mL；对枯草芽孢杆菌的MIC值为0.0625 g/mL，而对大肠杆菌无抑制作用。 表3大叶秦艽水煎液的MIC值 Tab.3 MIC of G. macrophylla Pall. decoction 大叶秦艽（g/mL） 1.0 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照 大肠杆菌 - - - + + + 金黄色葡萄球菌 +- - + + + + 枯草芽孢杆菌 + + + + + 注：“-”表示有抑菌作用；“+”表示无抑菌作用 130 表4小秦艽水煎液的MIC值 Tab.4 MIC of G. dahurica Fisch. decoction 小秦艽（g/mL） 1.0 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照 大肠杆菌 - - + + + + 金黄色葡萄球菌 - + + + + + 枯草芽孢杆菌 - - + + + + 注：“-”表示有抑菌作用；“+”表示无抑菌作用 表5麻花秦艽水煎液的MIC值 Tab.5 MIC of G. straminea Maxim. decoction 135 麻花秦艽（g/mL） 1.0 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照 大肠杆菌 + + + + + + 金黄色葡萄球菌 - - + + + 枯草芽孢杆菌 + + + + + + 注：“-”表示有抑菌作用；“+”表示无抑菌作用 表6大叶秦艽醇提物的MIC值 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
