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制药用水微生物检测方法研究 颜若曦* 作者简介：颜若曦，(1983-)，男，工程师，主要研究方向：药品质量控制。 E-mail: sssyrx@163.com （北京紫竹药业有限公司，北京 100024） 5 摘要：制药用水是药品生产企业应用最广泛的原料和清洗剂，尤其是纯化水和注射用水。其 中微生物指标是最重要的控制指标。当前，各国药典对纯化水和注射用水的微生物检测方法 基本一致，仅限度标准不同。但各国药典之间对制药用水的微生物检测方法却存在差异。本 文以纯化水作为制药用水的代表，对欧洲药典及美国药典制药用水微生物检测方法进行对比 分析，分别按欧洲药典及美国药典纯化水微生物检测方法检测纯化水中的各典型微生物，通 10 过对实验数据的方差分析，判断欧美药典微生物检测方法对各典型微生物是否存在显著性差 异，进而确认最优检测方法。并对此方法进行验证，检测此方法对各类微生物的回收率，保 证此方法的准确性。在此基础上，同时使用上述试验获得的最优检测方法与中国药典制药用 水微生物检测方法对一组纯化水系统的关键使用点实施同步监测，考察两种方法检测结果的 差异性。为制药用水微生物检测提供依据，指导制药企业在制水系统日常监测及验证中进行 15 微生物检测方法的选择，为制药企业建立同时符合中、美、欧药典要求的制水系统提供微生 物检测方法参考，降低质量成本。 关键词：药品检测；纯化水；制药用水；微生物；显著性分析；方法验证 中图分类号：TQ 0 引言 40 水是制药工业中应用最广泛的工艺原料，常用做药品的组成成分、溶剂、稀释剂等。同 时水广泛应用于制药设备和系统的清洗。而水却极易滋生微生物并助其生长，微生物指标是 其最重要的指标。[1] 制药用水通常包括饮用水、纯化水、注射用水和灭菌注射用水。当前， 各国药典对纯化水和注射用水的微生物检测方法基本是一致的，仅微生物限度标准不同。但 各国药典之间对制药用水的微生物检测方法却存在差异。[2-5]其后果是：仅按一部药典进行 45 微生物检测获得的数据很难被其他药典标准认同，进而导致对制水系统、制药用水，乃至产 品质量受到的质疑。本文拟确认一种各国药典均认同的制药用水微生物检测方法，为制药企 业解决此问题提供思路。 实验以纯化水作为制药用水的代表，对欧洲药典及美国药典制药用水微生物检测方法进 行对比分析，分别在纯化水中加入各类代表性微生物，同时按欧洲药典、美国药典纯化水微 50 生物检测方法进行检测，通过对检测数据的方差分析，判断欧洲药典与美国药典微生物检测 方法是否存在显著性差异，根据各典型微生物回收率情况确认最优检测方法。同时按欧美药 典要求对此方法进行验证，检测对各类微生物的回收率，进一步保证此方法的准确性。在此 基础上，使用此最优检测方法与中国药典制药用水微生物检测方法对纯化水系统的关键使用 点实施同步监测，考察检测结果差异性。指导制药企业在制水系统日常监测及验证中选择微 55 生物检测方法，并为各制药企业建立一种同时符合中国药典、欧洲药典及美国药典要求的制 药用水微生物检测方法提供参考。进而在保证制药用水微生物检测结果有效性的同时，降低 检测成本。 1 实验试剂与仪器 1.1 实验试剂及培养基 60 1.1.1 培养基 平板计数琼脂培养基干粉试剂、胰蛋白胨大豆琼脂培养基干粉试剂、胰蛋白胨大豆肉汤 培养基干粉试剂、沙氏葡萄糖肉汤培养基干粉试剂、沙氏葡萄糖琼脂培养基干粉试剂：BD 公司； R2A 琼脂培养基干粉：OXOID； 65 营养琼脂培养基干粉试剂、玫瑰红钠琼脂培养基干粉试剂、沙氏葡萄糖琼脂培养基干粉 试剂、pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液干粉试剂：北京三药科技开发公司。 1.1.2 试剂、实验用水及耗材 0.9％无菌氯化钠溶液：OXOID；纯化水：北京紫竹药业有限公司；0.45μm 无菌纤维滤 膜：Sartorius Stedim Biotech。 70 1.2 实验菌种 金黄色葡萄球菌（CMCC 号：26003），大肠埃希菌（CMCC 号：44102），枯草芽孢杆 菌（CMCC 号：63501），铜绿假单孢菌（CMCC 号：10104），白色念珠菌（CMCC 号： 98001），黑曲霉（CMCC 号：98003）。 实验用菌种均按药典规定，取3-5 代菌种的新鲜培养物制备菌悬液，2℃～8℃保存24h 75 内使用。 1.3 实验仪器 生化培养箱：海尔集团；超净工作台：北京昌平长城空气净化工程公司；生物安全柜： 北京东联哈尔仪器厂；普通卧式压力蒸汽灭菌器：山东新华医疗器械厂；pH 计：梅特勒·托 利多。 80 2 美国药典与欧洲药典纯化水微生物检测方法分析 2.1 纯化水微生物检测方法描述 2.1.1 美国药典纯化水微生物检测方法及质量标准 美国药典在第1231 章<制药用水>中推荐使用0.45μm 滤膜采用薄膜过滤法，并建议同 时使用高营养培养基和低营养培养基检测制药用水中的微生物。高营养培养基（例如：标准 85 方法平板计数琼脂）在30℃～35℃培养72 小时以上，低营养培养基（例如：R2A 琼脂）在 20℃～25℃培养96 小时以上。 质量标准：≤100cfu/mL。[3] 检测操作详述（可根据实际情况调整）：量取10ml 充分混匀的水样，以无菌操作加入 安装好的薄膜过滤器内，过滤。并用pH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每张滤膜 90 每次冲洗量为100ml，共冲洗1 次。过滤后，取出滤膜，正面朝上贴于琼脂平板上。共制备 2 张滤膜，一张滤膜贴于平板计数琼脂培养基平板（高营养培养基），置30℃～35℃生化培 养箱中倒置培养2～3 天，计数。另一张滤膜贴于R2A 琼脂平板（低营养培养基），置20℃～ 25℃生化培养箱倒置培养5～7 天，计数。以培养基平板上菌落数生长较多者作为检测结果， 按比例折算为1ml 纯化水中的微生物数量后报告。 95 2.1.2 欧洲药典纯化水微生物检测方法及质量标准 欧洲药典纯化水各论微生物检测方法：使用薄膜过滤法（0.45μm 孔径滤膜），使用R2A 琼脂培养基在30℃～35℃培养5 天以上。 质量标准：≤100cfu/mL。[4] 检测操作详述（可根据实际情况调整）：量取10ml 充分混匀的水样，以无菌操作加入 100 安装好的薄膜过滤器内，过滤。并用pH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每张滤膜 每次冲洗量为100ml，共冲洗1 次。过滤后，取出滤膜，正面朝上贴于R2A 琼脂平板上, 置 30℃～35℃生化培养箱中倒置培养5 天，计数。按比例折算为1ml 纯化水中的微生物数量后 报告。 2.1.3 美国药典与欧洲药典纯化水微生物检测方法对比 105 如上，欧洲药典和美国药典对纯化水微生物的检测操作基本相同，均采用薄膜过滤法， 但在检测用培养基、培养条件及培养时间方面有所区别，具体见表1。 表1 欧洲药典与美国药典纯化水微生物检测方法对比 药典名称 微生物检测方法 培养基 培养温度 培养时间 欧洲药典7.0 薄膜过滤法 R2A 琼脂培养基 30℃～35℃ 5天 美国药典 薄膜过滤法 R2A 琼脂培养基（低营养培养基） 20℃～25℃ 5天 (USP35-NF30) 薄膜过滤法 平板计数琼脂培养基（高营养培养基） 30℃～35℃ 3天 注： 培养时间可根据实际培养情况适当延长。 110 2.2 美国药典与欧洲药典纯化水微生物检测方法差异分析 根据本文表1，欧洲药典与美国药典纯化水微生物检测方法的区别主要包括检测培养 基、培养温度和培养时间，概括起来有3 种不同条件。为考察此3 种纯化水微生物检测方法 实际检测能力之间的关系，拟使用常见微生物的典型菌株（表3）分别按检测方法的3 种不 115 同条件进行检测，使用单因子方差分析的方法考察3 种不同条件对各类微生物典型菌株检测 能力之间是否存在显著性差异。 2.2.1 实验设计 以纯化水微生物检测方法为因子（使用字母A 表示），使用不同检测方法（不同的因 子水平，见表2）获得的微生物计数结果服从正态分布，检测结果之间相互独立，其方差相 120 等。通过考察不同方法对各类常见微生物典型菌株的检测结果之间是否存在显著性差异，进 而判断检测方法之间是否存在显著性差异。 表2 因子水平（Ai）与检测方法对应关系表 因子水平 检测方法说明 方法来源 A1 平板计数琼脂培养基，30℃～35℃，培养3 天； USP A2 R2A 琼脂培养基，于30℃～35℃，培养5 天； ph.Eur A3 R2A 琼脂培养基，于20℃～25℃，培养5 天； USP 125 表3 常见微生物典型菌种列表 微生物类别 典型代表菌种 菌株编号(CMCC) 革兰氏阴性菌 大肠埃希菌；铜绿假单胞菌 44102；10104 革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌 26003 芽孢菌 枯草芽孢杆菌 63501 酵母菌 白色念珠菌 98001 霉菌 黑曲霉 98003 2.2.2 实验方法 1） 菌液制备 接种铜绿假单孢菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰蛋 130 白胨大豆肉汤中于30℃–35℃，培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡 萄糖琼脂中于20℃–25℃，培养48～72 小时。上述培养物用pH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液， 采用10 倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7 制成每1ml 含菌数小于100cfu 的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂表面，于20℃–25℃培养5～7 天，加入3～ 5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的pH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后， 135 取底部附有无菌棉的漏斗过滤，用无菌吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v） 聚山梨酯80 的pH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液采用10 倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6， 制成每1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。 2） 对比试验 学术论文网Tag：代写代发论文 代写医学论文 医学论文发表 |
