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急性CO中毒大鼠脑海马区多巴胺类神经递质的变化特点# 关里，朱明霞，赵金垣，张雁林** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金 （编号：200800011047） 作者简介：关里（1976-），女，助理研究员，主要研究方向：化学中毒的分子机制 通信联系人：赵金垣（1942-），男，教授，主任医师，主要研究方向：化学中毒的分子机制. E-mail: zhaojinyuan@sina.com （北京大学第三医院 职业病研究中心，北京 100191） 5 摘要：目的 研究急性一氧化碳（CO）中毒大鼠脑海马多巴胺（DA）及其代谢产物二羟苯乙酸（DOPAC）、高香草酸(HVA)水平的变化特点。方法 将大鼠随机分成对照组和CO中毒组，采用腹腔注射CO法染毒，首次染毒剂量为120ml/kg，每隔4小时注射一次，剂量为60ml/kg，连续间隔注射3次；对照组以同种方法和剂量注射空气。进一步利用Morris水迷10 宫实验、脑组织病理学检查方法鉴定出迟发性脑病组大鼠和非迟发性脑病组大鼠，通过在体微透析技术观察脑海马区DA及其代谢产物至末次染毒12 h及迟发性脑病期的水平变化特点。结果 腹腔注射CO末次染毒后，大鼠脑海马区DA水平增加，其代谢产物明显减少；4～6h以后，随着血中CO水平下降，上述变化亦逐渐消失，11h左右大致恢复至正常水平；与对照组比较，出现迟发性脑病的大鼠海马区DA水平再次明显增加，其代谢产物水平则再次15 明显降低。结论 急性CO中毒及CO迟发性脑病均可见DA及其代谢产物出现异常变化，推测此种变化可能与中枢神经系统损伤症状有关。 关键词：一氧化碳中毒；迟发性脑病；多巴胺；海马；微透析 多巴胺（DA）在维持脑基本功能（精神、情绪、意识等）及控制对外界环境的反应（运动、知觉、呼吸）等方面具有特殊的重要性，一直是神经科学领域的研究热点[1]。近年的研究证 实DA在缺氧缺血性脑损伤中扮演重要角色。急性一氧化碳（CO）中毒后不但可引起急性45 脑缺氧缺血、脑水肿等，另外还有部分患者在中毒后经过一段表现正常或者接近正常的“假愈期”，又突然再次出现一组以痴呆为主伴有锥体外系症状的神经精神损伤，即迟发性脑病（CMDEP）[2，3，4]，既往研究显示急性CO中毒后续发性脑循环异常与CMDEP发展密切相关[5，6，7]。本次研究中将利用在体微透析技术，观察急性CO中毒大鼠脑海马多巴胺及其代谢产物的动态变化，以探讨海马多巴胺分泌变化在CMDEP的意义。 50 1 材料与方法 1.1 材料 实验动物为 SD大鼠，体重250-300g，由北京大学医学部动物实验中心提供；CO纯品由北京兆格气体有限公司提供（体积分数99.95%）；高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ED）由美国Agilent1100液相恒流泵、HP1049电化学检测器、玻璃碳工作电极(以Ag/ AgCl 为参55 考电极)组成；柱为C18反相色谱柱( ODS , 150 mm ×4.6 mm ,5μm)，标准品DA、DOPAC、HAV 均为Sigma 产品；实验中所用其它试剂为进口或国产分析纯试剂。 1.2 实验方法 1.2.1 动物分组 １）急性CO中毒组：参照王耀宏等人建立的方法[8]制备急性CO中毒迟发性脑病模型，60 CO中毒组首次经腹腔注射纯品CO气体，首次剂量120ml/kg，每隔4h追加注射一次共4次注射，维持剂量为60ml/kg。 2）对照组：对照组按同样方法和剂量注射空气。 3）迟发性脑病组：急性CO染毒大鼠在染毒后至14d间，通过Morris水迷宫行为学实验，鉴定染毒大鼠发生迟发性脑病[5]，并在行为学实验结束后通过神经病理学检查进一步验65 证其存在脑损伤。Morris水迷宫训练程序[9，10]：定位航行试验，模型染毒后第10天开始，历时5天9个时间段，每天训练4次，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其寻找到平台的时间（逃避潜伏期, escape latency）和游泳路径，观测其逃避潜伏期长短检测动物学习能力。大鼠学习记忆损伤标准[11]：以对照组大鼠平均逃避潜伏期均数+ 2倍标准差值为下限，+ 1倍标准差值为上限，将大鼠区分是否有学习记忆功能障碍。平均逃避潜伏期70 大于均数+ 2倍标准差的为迟发性脑病组。 4）非迟发性脑病组：将Morris水迷宫行为学实验结果显示的平均逃避潜伏期小于均数+1倍标准差为学习记忆功能正常的非迟发性脑病组。在完成Morris水迷宫及微透析实验后取大鼠脑海马行Nissl染色。潜伏期介于上下限之间的大鼠因不能确定它们学习记忆功能减退程度，为避免混淆，从实验中剔除。 75 1.2.2 在体微透析实验方法 麻醉SD大鼠(戊巴比妥钠400mg/kg ,ip)，将头部脱毛大鼠固定在立体定位仪上(固定门齿棒、耳棒，确保头部位置的正确)，暴露头骨，确定前卤位置，并将CMA/12探针套管对 准此点，按立体定位仪座标：AP 4.0mm，ML 5.3mm，DV 2.3mm[12]值定位，使CMA/ 12 探针套管缓慢降至所需海马深度。用外科水泥固定套管，手术后局部用青霉素抗感染，18～24h80 后进行微透析实验。透析时拔除套管进入探针，探针进口管连接CMA/100微透析泵，以1.5μl／min速度灌流，（液灌流成分147.0 mmol/L NaCl, 4.0 mmol/L KCl, 1.0 mmol/L MgCl2, 2.20 mmol/L CaCl2, 0.45 mmol/L Na2HPO4, pH 7.4），出口管连接HoneyCombTM 低温收集器，每30min收集1管样品，加入5μl抗氧化剂（0.4mol/L 高氯酸溶液）后立即用HPLC-ED检测。 急性CO染毒大鼠与对照组大鼠分别在末次腹腔注射后行微透析实验取样，取样间隔时85 间为30min，直至末次染毒后12h，共取材12次。 迟发性脑病组大鼠与非迟发性脑病组大鼠分别在Morris水迷宫行为学实验初步鉴定完成后，行微透析实验取样，取样要求为样品收集经检测后达稳定后即可。 1.3 数据处理与统计分析 微透析实验首先以各标准品浓度对色谱峰面积制作标准曲线，然后计算每组动物每个样90 品的基础透析浓度。采用SPSS11.0软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用student’s t-检验。 2 结果 2.1急性CO末次染毒后，大鼠脑海马多巴胺及其代谢产物含量变化 与对照组比较，急性CO末次染毒后，染毒组脑海马区DA含量明显增加，其代谢产物95 3，4-二羟苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）均显著下降，尤其在末次染毒后的2～6h更明显，在此观察时间段检测发现CO染毒组大鼠海马区DA及其代谢产物的含量变化与对照组比较具有显著性差异（P<0.05），CO染毒12h后大鼠海马区DA及其代谢产物均逐渐恢复至对照组水平（见图1）。 100 图1 CO中毒后大鼠海马多巴胺及其代谢产物的变化 A,B,C分别为DA, DOPAC, HAV动态观察的浓度变化曲线；各组数据表示为基础水平百分比，对照组和CO中毒组DA基础值分别为：0.415±0.12, 0.436±0.12 pmol/45μl/30min ，与对照组比较：*P<0.05 105 2.2 迟发性脑病模型和非迟发性脑病模型鉴定结果 根据实验方法中大鼠学习记忆损伤判定标准，本研究中急性CO染毒大鼠共50只，染毒24 h 内死亡17只，在染毒14 d 后，存活大鼠中有8只出现学习记忆功能障碍（图2）。 图2 大鼠行为学研究统计结果 110 每个点代表每只实验大鼠平均逃避潜伏期， ：低限（19.89s） , 高限：（22.5s）. Nissl染色病理学检查结果显示，对照组大鼠脑海马锥体细胞排列整齐致密，可见多层锥体细胞，细胞形态完整，边界清晰，尼氏体丰富，胞核大而圆，染色较浅，核仁深染清晰。迟发性脑病模型大鼠海马锥体细胞缺失，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数细胞胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏体减少或者消失，尤以DG神经元密度降低显著（图3）。 图3大鼠脑海马Nissl染色（200×） A、B、C：对照组大鼠模型海马，A：CA1区，B：CA3区，C：DG区； D、E、F：迟发性脑病大鼠模型海马，D：CA1区，E：CA3区，F：DG区 120 2.3迟发性脑病组与非迟发性脑病组大鼠海马区DA及其代谢产物含量测定结果 微透析实验取样稳定后，对照组大鼠每30min透析样品中DA及其代谢产物基础值分别为：0.36±0.15 pmol/45μl、17.17±4.78 pmo/l45μl、5.87±2.18 pmol/45μl。实验发现，非迟发性脑损伤组大鼠海马区DA浓度较对照组略降低，为对照组的86%，但二者差异无显著性意义；125 迟发性脑病组大鼠海马区DA含量较对照组明显约增加34%（图4，P<0.05），说明染毒14d后，迟发性脑病组大鼠海马区DA含量明显多于非迟发性脑病组大鼠。 观察不同组别DA代谢产物DOPAC和HVA含量发现，非迟发性脑病组大鼠海马区DOPAC和HVA含量显著降低，分别降低了47%和48%（图5，P<0.05），说明出现迟发性脑病组大鼠海马区DA代谢能力明显降低。 130 图4 不同组别大鼠脑海马多巴胺水平（注：与对照组比较，*P< 0.05） A B C D E F 135 图5 不同组别大鼠脑海马多巴胺代谢水平（注：与对照组比较，*P< 0.05） 3. 讨论 DA在运动协调、行为情感、认知以及神经内分泌调节等许多正常生理功能中具有重要意义，许多精神失调性疾病也与脑多巴胺神经系统功能障碍密切相关[13]。同时已经证实在140 大鼠海马CA1区的神经递质主要包括儿茶酚胺类递质、抗坏血酸和5羟色胺（5-HT），并有大量研究表明在脑缺血缺氧时上述递质蓄积。 脑内微透析技术可以收集清醒或麻醉状态下动物的脑细胞外液，微量注射泵将灌注液泵入探针，探针的透析膜与被取样的脑特定区发生物质交换，只有小分子物质顺浓度梯度泵入或泵出探针所在脑区，呈现一种动态连续的过程。 145 本研究利用在体微透析技术观察了急性CO中毒后12h内，以及迟发性脑病大鼠与未发生迟发性脑病大鼠，脑海马区DA及其代谢产物含量的变化特点。研究结果提示，DA及其代谢产物在急性CO中毒后，伴随血HbCO由高浓度水平恢复正常的过程，脑海马DA区含量呈现出由明显降低又迅速恢复正常的变化，其代谢产物则由末次染毒后的明显降低转至中毒12h后基本恢复至正常水平。同时发现迟发性脑病大鼠海马区的DA含量较费迟发性脑病150 大鼠明显增加，其代谢产物DOPAC和HVA浓度水平变化则与之相反。上述海马区DA及其代谢产物在大鼠急性CO中毒期和迟发性脑病期出现的不平行特征提示我们，急性CO中毒和迟发性脑病期均可有不同程度脑循环障碍导致的脑缺血缺氧发生，这一发现与前期研究已证实的急性CO中毒后可续发出现脑循环障碍的结论相一致，可能是出现CO中毒后迟发性脑病的重要原因之一[14，15]。 155 DA是哺乳动物大脑中最主要的儿茶酚胺类神经递质，占所有脑内儿茶酚胺类神经递质含量的80%。多巴胺通过其受体参与人类神经精神活动的调节，从而控制运动、认知、情感等。丰富的ATP和正常代谢对保持突触末梢DA区域化和正常摄取都极为重要。当出现 缺血缺氧时，细胞外液K+增多和大量的Ca2+内流促使DA释放增加，另一方面酪氨酸羟化酶受抑制，使DA合成增加。同时因脑组织能量耗竭，导致钠钾泵活性降低，重摄取受到抑160 制，这一系列的过程最终表现为脑缺血缺氧引起DA及其代谢产物水平异常[16]。 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
