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融合瘤苗防治胶质瘤研究# 王东海* 基金项目：教育部博士点基金（200804220042） 作者简介：王东海，（1969-），男，副教授，主要研究方向：脑血管病与脑肿瘤的基础与临床. E-mail: drwangdonghai@163.com （山东大学齐鲁医院神经外科，济南 250012） 摘要5 ：目的: 探讨DC/C6 融合瘤苗防治C6 胶质瘤的疗效及作用机制。方法: 采用PEG 化学 融合方法制备融合瘤苗，应用GFAP-FITC 免疫荧光检查进行瘤苗的鉴定； 立体定向制备大 鼠颅内C6 肿瘤模型；于种瘤后5d 经尾静脉注射107 融合瘤细胞、107DC 以及100 μl PBS， 分设为A、B、C 3 组，采用Log-rank 对数秩检验进行生存分析，并行肿瘤标本HE 染色及 抗CD8M cab 免疫组化染色。结果: 融合瘤苗GFAP- FITC 免疫荧光检查阳性；Log-rank 生 10 存分析对数据进行对数秩检验，结果表明A 组与B、C 组进行比较均有统计学意义(P < 0.01)； A 组晚期死亡大鼠( > 31 d) HE 染色见较多的炎性细胞浸润，CD8M cab 免疫组化染色阳性。 结论: DC /C6 融合瘤苗能够有效的发挥抗原提呈、活化T 淋巴细胞的功能, CD8+ T 细胞参 与抗胶质瘤免疫反应。 关键词：外科学；树突细胞；神经胶质瘤；瘤苗；免疫疗法 0 引言 在融合瘤苗应用方面, 国内外学者进行了许多有益的尝试, 取得了较好的效果, 而神经 外科领域DC 融合瘤苗抗胶质瘤的应用研究较少，为此，本实验采用融合瘤苗对大鼠颅内 40 C6 胶质瘤动物模型进行防治的实验研究。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 主要试剂和仪器 PEG (MW: 4000) ( G ib ico)、rGM- CSF( R&D )、rIL- 4( R&D)、MMC ( Sigma)、胶质纤 维酸性蛋白免疫组化试剂盒( GFAP, S igma)45 、荧光显微镜( O lympus)、FACscalibur 流式细胞 仪( Becton Dickinson)、脑立体定向仪( Stoelt ing)。 1.1.2 细胞株 C6 胶质瘤细胞株来源于W istar 大鼠，由山东省医学科学院免疫实验室张建华老师惠赠。 1.2 方法 50 1.2.1 融合瘤苗的制备 ①DC 的诱导分化 梯度离心法分离大鼠骨髓来源的单核细胞，血清包被的培养皿中孵 育2 h， 收集非粘附细胞，6 孔培养板中加入细胞2.5×106 cells/w ell 添加细胞因子( GM-CSF 5 μg /L，IL- 4 5 μg /L), 37 ℃饱和湿度下5% CO2 孵箱中培养，每2 d 半量换液并添加细胞因 子1 次, 10-12 d 收获悬浮DC。 55 ②DC /C6 的融合、筛选、纯化与鉴定 参照Masaya 等[1]的融合方法，DC 与C6 按2：1 混合，取PEG(MG4000)液0.5 ml 加入混合细胞中，快速吹打并静置90 s，无血清RPMI-1640 培养液终止反应；调整融合细胞浓度为1010 cells/l，按100 ml /l 的剂量加入小鼠抗大鼠 OX62-RPE 工作液, 流式细胞仪收集OX62+细胞。培养72 h 分别收集贴壁细胞及悬浮细胞， 行GFAP-F ITC 免疫荧光检查。 60 1.2.2 DC/C6 融合瘤苗的免疫治疗实验 ①制备C6 颅内胶质瘤模型 采用立体定向技术向大鼠颅内植入C6 细胞20 μL(约l06 个细胞) ，靶点取冠状缝前1.0 mm，矢状缝右旁开3.0 mm，硬膜下5.0 mm 处，微量泵缓 慢注入，制备大鼠颅内肿瘤模型30 只。 ②融合瘤苗治疗荷瘤大鼠 随机将30 只大鼠每组10 只分为A、B、C 3 组，种瘤后5 d 65 经尾静脉注入瘤苗治疗(每次100 μL)，采用1 × 107DC/C6 瘤苗、1 ×107DC 和PBS 液100 μ l 分别对3 组大鼠进行免疫治疗，间隔1 周，共治疗3 次。 ③肿瘤灶的病理检查 大鼠死亡后取脑组织浸入4%的多聚甲醛液中，4℃过夜固定处理， 继而放入含15% 蔗糖的PBS 液中，4℃温度下保存2 d，20 μm 常规冰冻切片，部分切片 标本进行HE 染色；将用于免疫组化染色切片标本经PBS 液反复漂洗后，滴加小鼠抗大鼠 70 CD8M cab，4 ℃过夜，PBS 液冲洗后，加入羊抗鼠二抗，了解各组肿瘤标本的CD8+T 细胞 浸润情况。于种瘤后40 d 终止实验，对于生存期超过40 d 的大鼠处死后采用上述相同的病 理学检查方法。 ④大鼠的生存分析 采用Kaplan-meier 法进行生存评估，Log-rank 对数秩检验进行数据 分析。 75 2 结果 2.1 GFAP-FITC 免疫荧光检查 贴壁生长的OX62 +细胞GFAP-FITC 免疫荧光染色，荧光显微镜下见细胞染色后有强的 绿色荧光表达，即OX62+细胞表达C6 的标记物(图1)，悬浮生长的OX62+细胞GFAP-FITC 免 疫荧光染色阴性。 80 2.2 免疫治疗大鼠的生存情况 由大鼠生存曲线可看出(图2)，A 组大鼠有5 只死亡，至40 d 时仍有5 只存活，中位生 存时间为38.5 d，B 组中位生存时间为( 23±1) d，C 组中位生存时间为Log-rank 生存分析 对数据进行对数秩检验，结果表明A 组与B、C 组进行比较均有统计学意义(P < 0.01) , 而 B 组与C 组差异不显著(P > 0.05)。 85 2.3 免疫治疗大鼠脑组织标本病理学检查 B 组及C 组HE 染色肿瘤内坏死、出血及新生血管多见，细胞增殖活跃，未见明显的 炎性细胞浸润；A 组大鼠早期死亡( 20 d、25 d)脑肿瘤组织HE 染色与B 组及C 组的镜下所 见相同，而晚期死亡组( >31 d)出现肿瘤凝固坏死、新生血管少见，可见较多的炎性细胞浸 润；A 组5 只大鼠40 d 处死病理检查；2 只未见肿瘤组织，余3 例肿瘤组织与晚期死亡大 90 鼠所见基本相同。大鼠脑肿瘤标本CD8Mcab 免疫组化染色显示，A 组肿瘤组织内有较多的 CD8+ T 细胞浸润，而B 组、C 组大鼠均未出现明显的CD8+T 细胞浸润。 3 讨论 颅内胶质瘤采用综合治疗措施，几乎所有病人均出现复发，5 年生存率低于5.5%，平 均生存期仅为1 年[2]。由于预后极差，人们一直努力寻找新的治疗方法，尤其是在生物及基 95 因治疗领域，人们开展了许多有益的研究工作。本课题采用DC/C6 融合瘤苗对胶质瘤进行 实验研究，通过PEG 化学融合方法获得融合瘤苗，通过瘤苗的持续性抗原提呈能力，将C6 胶质瘤的肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原提呈给杀伤性T 细胞，通过主动免疫的方式，发 挥治疗作用。 为了保证免疫治疗的效果，选用合适的肿瘤细胞株以及同源模型动物十分重要。本实验 100 中采用的C6 细胞系是经N-亚硝基甲脲( N-nitrosomethyl-urea)诱发的Wistar 大鼠脑胶质瘤， 能够在体内、体外传代培养，生长稳定，原位种植成瘤率高，并且表达GFAP 胶质瘤特异性 标志。在动物的选择方面，由于非同源基因荷瘤动物接种肿瘤细胞可因MHC 差异发生种植 免疫排斥反应，造成肿瘤自然消退而模拟治疗产生的效果，所以在免疫治疗中，对肿瘤细胞、 载瘤动物及其两者之间基因相同性的要求极为重要[3, 4]。为避免由于免疫源性不同而出 105 现的模拟治疗效应, 本实验中采用了同源的Wistar 大鼠作为C6 载瘤动物模型，从而保证了 融合瘤苗效价评定的准确性。 Wistar 大鼠脑内荷瘤动物模型建立后，治疗时机的选择尤为重要，治疗时间窗的选择应 在肿瘤指数生长期以前，此期间进行治疗干预才能更好地判定治疗效果，Wistar 大鼠接种后 3 d 有肿瘤形成，接种后5 d 开始进入指数生长期，因而治疗时间窗为3-5 d[5] 。根据上述， 110 本实验选择治疗时间窗为接种后5 d，采用立体定向技术靶点缓慢注射，延迟拔针，保证了 实验动物能够有一个较长的携瘤生存状态，避免了应用琼脂糖或永久埋管种植等方法的复杂 性[4]，又能确保模型的成功率和标准化。 胶质瘤病人处于免疫抑制状态，在胶质瘤局部免疫抑制因子如IL-10 和VEGF 的表达水 平随胶质瘤的恶性程度增高而升高，其对DC 功能的抑制作用逐渐加深，使其不能发挥作用 115 [6]；文献[7, 8]报道骨髓来源的DC 有较高的T 细胞刺激活性和抗原加工、提呈能力；骨髓来 源的DC 与脾脏来源的DC 相比，与肿瘤细胞融合后能获得更多的表达DC 标志并具有功能 的融合瘤苗；在肿瘤疫苗免疫注射次数与疫苗的注射数量方面，采用的瘤苗注射量为1×107， 对接种3 次与7 次的疗效评估看，效果一样，并指出过多的应用瘤苗有引致T 细胞功能衰 竭的危险。因而，本实验采用骨髓来源的DC 制备瘤苗，经大鼠尾静脉注射融合瘤苗进行免 120 疫保护与免疫治疗的研究，采用相同的疫苗用量及疗程, 未见大鼠出现T 细胞功能衰竭的情 况发生，获得较为理想的免疫保护与免疫治疗效果。采用种瘤后5 d 对大鼠进行免疫治疗， 较好地模拟了胶质瘤病人切除术后早期状态，从而能更加客观地反映瘤苗的治疗效果；融合 瘤苗治疗组大鼠的中位生存时间为38.5 d，40 d 生存率为90%，与DC、PBS 组相比，其 MST 与后两者相比均有统计学意义，而DC、PBS 两组之间比较不具有统计学意义，并且融 125 合瘤苗治疗组尚有2 例治疗后肿瘤完全消失，长期存活。在DC/C6 融合瘤苗组早期死亡大 鼠的瘤组织HE 染色所见与DC、PBS 组的病理改变相一致， 肿瘤内细胞增生活跃，可见瘤内出血和新生血管；晚期死亡组大鼠瘤内细胞凝固性坏死， 并见较多的炎性细胞浸润；对肿瘤组织进行免疫组化检查，融合瘤苗治疗组晚期死亡大鼠肿 瘤组织内出现明显的CD8+T 细胞阳性表达，表明融合瘤苗对C6 细胞具有免疫治疗作用， 130 CD8+ T 淋巴细胞为发挥抗肿瘤免疫的主要功能细胞[9]。 图1.贴壁生长的OX62+细胞GFAP-FITC 免疫荧光表达（×200）。 Figure 1. OX62+ cell growing adheresively with expression o f GFAP-FITC in immunofluo rescence (×200). 图2. 不同方法免疫治疗实验大鼠的生存曲线 Fig. 2 Survival time of rats in different groups treated with PBS, DC and DC/C6 fusion cells, separately. 4 结论 140 应用DC 疫苗治疗鼠脑胶质瘤模型的疗效是明确的，专职的抗原递呈细胞对肿瘤抗原 的递呈是克服肿瘤引起免疫抑制的关键，其优点显而易见。但是，作为一种免疫治疗方法， 大多数的成果是动物实验研究取得的，许多具体的病理生理过程尚不十分明了，仍有待于进 一步的研究。 145 [参考文献] (References) [1] Masaya K, Hitoshi I, Toshiyuki T, et al. Vaccination of fusion cells of rat dendritic and carcinoma cells prevents tum or growth in vivo[J]. Int J Cancer, 2003, 105(8): 520-526. [2] Parker JN, Gillespi GY, Love OE, et al. Eng ineered herpes simplex virus expressing IL-2 in the treatment o f experimental murine brain tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(5): 2208-2213. 150 [3] Grafts D, Wilson CB. Animal models for brain tumors[J]. Natl Inst Monogr, 1977, 46(1): 11-17. [4] Saini M, Bellinzona M, Meyer F, et al. Morphometrical characterization of two glioma models in the bra in o f immunocompetent and immunodeficient rats[J]. J Neuro oncol 1999, 42(1): 59-67. [5] 王晓刚，魏学忠，周定标. Wistar 大鼠C6 胶质瘤动物模型的肿瘤生长特点[J]. 军医进修学院学报，2001， 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
