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糖尿病患者基因组DNA甲基化水平的离子交换色谱法检测# 易斌1，张浩1，蔡旭2，黄婧1* 基金项目：教育部高等院校博士点基金新教师项目（200805331159） 作者简介：易斌（1978-），女，主治医师，主要研究方向：糖尿病肾病. E-mail: yibin_yb@163.com （1. 中南大学湘雅三医院肾内科，长沙，410013； 5 2. 广东省第二人民医院肾内科，广州 510317） 摘要：目的：通过改进离子交换色谱法，检测糖尿病患者外周血总基因组DNA甲基化水平。方法：提取48例糖尿病非肾病患者、42例糖尿病肾病患者和30例健康对照的外周血白细胞DNA；采用美国HP Agilent 1100色谱工作站，应用离子交换色谱法检测各组总基因组10 DNA甲基化水平。结果：离子交换色谱法可较好地分离DNA中的脱氧胞嘧啶核苷和5-甲基脱氧胞嘧啶核苷。糖尿病非肾病组总基因组DNA甲基化水平为4.71％±0.03％，糖尿病肾病组为5.23％±0.09％，健康对照组为4.37％±0.01％，三组比较差异无统计学意义（p >0.05)。结论：糖尿病患者（无论有无肾病）总基因组DNA甲基化水平与健康对照无显著差异。 15 关键词：基因组DNA甲基化；糖尿病；离子交换色谱法 0 引言 40 目前，全球糖尿病患者已达1.71亿，据推测到2030年该人群总数可能翻倍[1]。我国糖尿病的发病率由上世纪90年代的不足4%，到2007年调查结果的11%，以惊人速度飙升。据国家卫生部调查显示，我国每天约新增3000例，每年约增加120万糖尿病患者，其中约95%为2型糖尿病患者[2]。即使糖尿病患者血糖控制良好，仍不可避免出现慢性肾脏损害， 甚至发生肾功能衰竭，目前，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）已经成为糖尿病主要45 的严重并发症，也是糖尿病患者致死和致残的主要原因。临床观察和流行病学资料表明，遗传背景在DN的发生中起着重要作用。 近年来，人们对表观遗传学进行了深入研究。DNA甲基化（DNA methylation）是最常见的表观遗传修饰方式之一，它是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应。研究表明，DNA甲基化参与了原癌基因表达、50 抑癌基因失活、氧化应激、炎症反应、免疫失衡、成纤维细胞活化等过程，与肿瘤、心血管疾病、慢性肾脏病、自身免疫病等许多疾病的发生发展有关[3-5]。Maier S等提出糖尿病也是DNA甲基化的候选疾病之一，认为DNA甲基化在2型糖尿病的形成中发挥了一定作用[6]。本文拟采用改良离子交换色谱法对糖尿病患者和健康对照外周血总基因组DNA甲基化水平进行检测分析。 55 1 材料与方法 1.1 研究对象纳入标准、排除标准及分组 所有入选对象符合1999年WHO的糖尿病诊断及分型标准。排除其他内分泌疾病、肝胆疾病、慢性肾炎、泌尿系感染、原发性高血压病、心力衰竭等疾病，且在近期无糖尿病酮症酸中毒及其他急性并发症，无肾损害药物用药史。共入选2型糖尿病患者90例（男5160 例，女39例），年龄(63.1±6.9)岁，均为湖南汉族人，彼此之间无亲缘关系。 分组：48例尿微量白蛋白排泄率< 20μg/min的患者为糖尿病非肾病组，42例尿微量白蛋白排泄率> 200μg/min的患者为糖尿病肾病组。30例年龄相匹配的健康体检者为健康对照组，经OGTT及实验室检查后排除糖尿病及其他系统疾病，其中男18例，女12例。各组的性别、年龄差异无统计学意义。 65 1.2 仪器与试剂 高效液相色谱仪（美国Agilent公司），基因组DNA纯化试剂盒（美国Promega公司）脱氧胞嘧啶核苷（dC）、5甲基脱氧胞嘧啶核苷（5mdC）及Nuclease P1（美国Sigma公司），RNase A、RNase T1、DNase I及碱性磷酸酶（美国MBI公司），色谱纯乙腈（美国Honeywell公司），苯酚/氯仿/异戊醇混合液（(25:24:1)）（美国Amresco公司）。 70 1.3 样品的处理 1.3.1 DNA的提取 按DNA纯化试剂盒说明书抽提EDTA抗凝静脉血基因组DNA，以紫外分光光度计测定DNA浓度，DNA浓度（μg/μL）=A260×DNA稀释倍数×50/1000。 1.3.2 DNA去RNA处理 75 参照文献[7]报道，取DNA溶液200μL（含DNA约20μg），加入RNase A 2μL和RNase T1 0.4μL，37℃反应4h，加入200μL苯酚/氯仿/异戊醇混合液，15000g离心5min后取上层水相于另一离心管中，加入3M醋酸钠20μL与无水乙醇550μL，轻轻来回颠倒可见白色DNA析出。15000g离心l0 min后去上清，70%乙醇冲洗两次后室温风干，加入45μL去离子水溶解备用。 80 1.3.3 DNA的水解 参照文献[8]方法在已去除RNA的DNA溶液中加入5μL酶解缓冲液（200mM醋酸、200mM甘氨酸、50mM氯化镁、5mM氯化锌及2mM氯化钙混合液，用氢氧化钠调节pH值为5.3）和1μL混合酶解液（2.5U/mL Nuclease P1和500U/mL DNase I），37℃温育过夜后，加入l00mM氢氧化钠5μL和1U/μL碱性磷酸酶1μL，37℃消化12h-24h，-20℃保存备85 用。 1.4 离子交换色谱分析 1.4.1 色谱条件 采用美国HP Agilent 1100色谱工作站；色谱柱为德国MN公司强阳离子交换色谱柱；流动相为60mM 醋酸+15%乙腈，用氢氧化钠调节pH为4.8，流速为1.0mL/min；检测器波90 长为276nm；柱温为28℃，进样量50μL[9]。 1.4.2 标准曲线制备 根据dC和5mdC在人体中的实际浓度，配制不同浓度的dC与5mdC单标准样品及混合标准样品（dC：9.316pmol/μL、18.631pmol/μL、37.263pmol/μL、74.535pmol/μL、149.05pmol/μL 、298.1pmol/μL 、596.2pmol/μL；5mdC：0.651pmol/μL、1.302pmol/μL、95 2.604pmol/μL、5.207pmol/μL、10.415pmol/μL、20.829pmol/μL、41.658pmol/μL）。对每种标样所得的dC与5mdC色谱峰面积行回归分析，建立两种脱氧核苷峰面积与浓度之间的直线关系式。 1.4.3 总基因组DNA甲基化水平测定 待测样品于室温下解冻，加入12mM HCl 50μL，混匀后手动进样50μL。基因组DNA100 甲基化水平用5mdC的含量在样品中总脱氧胞嘧啶核苷中所占的百分比表示，即5mdC摩尔浓度/(5mdC摩尔浓度+dC摩尔浓度)×100%。 1.5 统计学处理 数据处理采用Agilent ChemStation A.06.03化学工作站。 2 结果 105 2.1 标准品和样品的离子交换色谱分析结果 dC和5mdC标样单组分及混合组分经离子交换色谱分析，其标样单组分洗脱峰的保留时间与混合标样中该组分洗脱峰的保留时间基本一致，dc洗脱峰保留时间为8.008min，5mdC洗脱峰保留时间为9.997min（图1-A）。通过对不同浓度的dC和5mdC的色谱峰面积行回归分析，建立dC和5mdC峰面积与浓度之间的直线关系式。上述色谱条件可很好地将样品110 中dC和5mdC分离，其出峰时间分别为7.942min和10.025min，与标准品出峰时间基本一致，且其前后均无明显的杂质峰干扰（图1-B）。 2.2 各组总基因组DNA甲基化水平 根据样本中dC和5mdC的峰面积得到对应的浓度，进而计算样本的甲基化水平，基因组DNA甲基化水平=5mdC摩尔浓度/(5mdC摩尔浓度+dC摩尔浓度)×100%。糖尿病非肾病115 组总基因组DNA甲基化水平为4.71％±0.03％，糖尿病肾病组为5.23％±0.09％，健康对照 组为4.37％±0.01％，三组比较差异无统计学意义（p >0.05)（表1）。 A dC 5mdC 120 B A T G dC 5mdC 图1 标准品（A）和待测样品（B）离子色谱图 125 Fig. 1 Ion chromatogram of standard (A) and samples (B) 注：A为腺嘌呤核苷，T为胸腺嘧啶核苷，G为鸟嘌呤核苷，dC为胞嘧啶脱氧核苷，5mdC为5-甲基胞嘧啶脱氧核苷。 表1 各组外周血基因组DNA甲基化水平（离子交换色谱分析） Tab. 1 Genomic DNA methylation levels in peripheral blood of different groups 130 (by ion-exchange chromatography) 组别 5mdC/dC+5mdC(%) 糖尿病非肾病组 4.71±0.03 糖尿病肾病组 5.23±0.09 健康对照组 4.37±0.01 注：dC为胞嘧啶脱氧核苷，5mdC为5-甲基胞嘧啶脱氧核苷。 3 讨论 近年来，人们对表观遗传学进行了深入研究，意图从基因序列变异以外因素的作用探索疾病发生的机理，这可能对正确认识与外界因素相关的人类重大疾病具有更为重要的意义。135 DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传修饰，在维持染色体结构、X染色体失活、基因印记和肿瘤的发生中起重要作用。研究甲基化的方法可分为三类：基因组整体甲基化水平的检测、基因启动子区域甲基化程度的检测和新的甲基化位点的寻找。高效液相色谱法为检测基因组DNA甲基化水平最常用的方法，由K C Kuo等1980年首次报道[10]，用酸或酶将DNA裂解为五类单核苷酸（包括5mdC），利用各种核苷酸在极性溶液中的不140 同溶解度及出柱时间，计算5mdC/（5mdC+5dC）的积分面积可得到基因组整体甲基化水平，但因该方法在分离过程中需做梯度洗脱而导致分离时间明显延长。2008年Rozhon W等[8]采用离子交换色谱法对植物基因组DNA甲基化水平进行了检测，大大缩短了分离时间。李峥等[9]参考其方法稍做修改并优化色谱条件，对人外周血白细胞基因组DNA整体甲基化水平进行了检测，结果显示该方法准确迅速简便，可用于高通量混合样本检测。我们研究结果145 显示标样单组分及混合标样中dc和5mdC洗脱峰保留时间分别为8.008min和9.997min，样品DNA中dC和5mdC出峰时间分别为7.942min和10.025min，与标准品出峰时间基本一致，与李峥等报道也基本相符。 2002年Maier S等[6]提出糖尿病是DNA甲基化的候选疾病之一，认为DNA甲基化在2型糖尿病的形成中发挥了一定作用。如胎儿出生前的葡萄糖和胰岛素水平能在胰岛素靶组织150 （如脂肪组织，肌肉组织和肝脏）中存在遗传印迹而影响出生后2型糖尿病的发生[11]。研究显示甲基化导致的锌指蛋白基因沉默[12]及母体的低甲基化综合征[13]与新生儿短暂性糖尿病密切相关，该病可导致成年后对糖尿病的易患性。Kuroda A[14]等研究发现人和小鼠胰腺β细胞中胰岛素启动子呈明显去甲基化状态，Yang BT[15]等进一步检测了9位2型糖尿病患者和48位非糖尿病患者胰岛组织，结果显示糖尿病患者胰岛素启动子DNA甲基化水平高155 于非糖尿病患者，与胰岛素表达呈负相关，与HbA1c水平呈正相关，提示DNA甲基化调控了胰岛素的表达。目前，对糖尿病患者基因组DNA整体甲基化水平的临床研究尚未见报道。我们研究结果显示无论是糖尿病肾病患者还是非肾病患者，外周血全基因组DNA甲基化水平健康对照组比较，差异均无统计学意义。其具体原因及机制尚不十分清楚，可能与基因组整体甲基化水平是各脏器多基因甲基化程度的总和反映有关，王萍等[16]研究发现虽然糖尿160 病大鼠模型肾脏和胰腺组织的基因转录均下降，但肾组织基因组DNA甲基化水平是降低，而胰组织基因组甲基化水平升高。Nanayakkara等[17]研究也表明，慢性肾脏病患者的全基因组DNA整体甲基化水平与疾病分期及肾小球滤过率均无相关性。此外糖尿病患者体内存在高糖内环境紊乱、氧化应激、炎症反应及免疫失衡等复杂过程，DNA甲基化可能参与了这些过程的多个环节，上调或下调多个基因及因子的表达，从而最终对患者外周血总基因组165 DNA甲基化水平发挥一定的影响。 学术论文网Tag：代写论文 代写职称论文 论文发表 代写医学论文 |
