丹龙醒脑方对老年肾虚血管性痴呆大鼠模
型的海马BAX，BCL-2 蛋白表达及细胞
凋亡的影响#
5 周小青，危玲，何军锋，刘建新**
基金项目：教育部2008 博士点基金（200805410001），湖南省自然科学基金（09JJ6038）
作者简介：周小青，（1957- ），男，教授，中医计量诊断。
通信联系人：危玲，（1977- ），女，讲师，中医计量诊断. E-mail: 735592998@QQ.com
（湖南中医药大学基础医学院，长沙 410007）
摘要：目的：观察丹龙醒脑方对老年肾虚血管性痴呆大鼠模型海马bax，bcl-2 蛋白表达及
神经元凋亡的影响。方法：用D-半乳糖注射和甲状腺片混悬液灌胃建立老年肾虚大鼠模型，
随后行双侧颈总动脉间歇结扎加剪尾放血建立老年肾虚血管性痴呆大鼠模型。采用末端脱氧
10 核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡，免疫
组织化学方法检测Bcl-2、Bax 蛋白表达。结果：雌二醇组和丹龙醒脑方组抗凋亡基因bcl-2
蛋白表达显著增加，凋亡基因bax 蛋白表达降低，凋亡细胞显著减少。结论：丹龙醒脑方能
通过增强Bcl-2 的表达，抑制Bax 的表达，抑制神经元凋亡的方式，起到保护神经元，改善
痴呆大鼠学习记忆能力的作用，具有和雌激素相似的效应。
15 关键词：血管性痴呆；丹龙醒脑方；雌激素
 0 引言
脑缺血再灌注后神经细胞死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式，两者在病理形态、发生
机制上截然不同。坏死在缺血早期即出现，多处于严重缺血的部位；凋亡则更多表现为迟发
性细胞死亡，通常分布在缺血半暗带区和远隔部位。1972 年，Kerr 等[1]描述了一种在形态
40 学上和坏死完全不同的细胞死亡类型并称之为凋亡。细胞凋亡(apoptosis)是细胞的一种死亡
形式，即在某些生理或病理因素诱导下激活膜信号系统，启动有关调控细胞凋亡的程序基因，
最终导致细胞按一定程度控制自我破坏和死亡，以避免机体自身免疫应答过强造成损伤。又
 称为程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）[2]。其确切机制尚不清楚。细胞凋亡是
一种重要的生命现象，它不仅出现在生理状态下，更与许多疾病的发生有密切关系。本实验
45 用D-半乳糖注射和甲状腺片混悬液灌胃建立老年肾虚大鼠模型，随后行双侧颈总动脉间歇
结扎加剪尾放血建立老年肾虚血管性痴呆大鼠模型。观察丹龙醒脑方对老年肾虚血管性痴呆
大鼠模型海马bax，bcl-2 蛋白表达及神经元凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
50 1.1.1 实验动物
清洁级SD 雌性大鼠100 只，体重250g 左右，均购自湖南中医药大学动物实验中心，
实验动物合格证：SCXK（湘）2009-0004。
1.1.2 实验药品
D-半乳糖由上海国药集团化学试剂有限公司生产，批号：F20061025，购自长沙天科生
55 物有限公司。甲状腺片由浙江尖峰药业有限公司生产，批号：070302，购自长沙老百姓大药
房。苯甲酸雌二醇注射液由天津金耀集团有限公司生产，批号：1005051，购自长沙双鹤医
药有限责任公司。丹龙醒脑方购自湖南中医药大学杏林药号。水合氯醛由中国白鹤化工厂生
产，批号：20000924。
1.1.3 主要试剂
60 兔抗ChAT 多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司），兔抗BDNF 多克隆抗体（北
京博奥森生物工程有限公司），正常封闭血清（北京中山生物技术有限公司），生物素化二
抗（北京中山生物技术有限公司），SP 试剂盒（福州迈新试剂公司），DAB 显色试剂盒（福
州迈新试剂公司）。
1.1.4 主要仪器
65 AS-620 型冰冻切片机（英国），恒温水浴箱（上海实验仪器厂），OPTONIII 型万能显
微镜（德国），image-propus（IPP）图像分析系统（美国），XG-1 型照像机（日本）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物造模方法、分组
从第一周开始，按150mg∕kg 的标准给每只大鼠行后颈部皮下注射D-半乳糖，连续6
70 周，42 天。第四周，加用灌胃造模。按2.5mg∕只的标准行甲状腺片混悬液灌胃，连续3
周，21 天。注射和灌胃造模完成后，行双侧颈总动脉结扎造模。用3.5%的水合氯醛，按1ml
∕100g 体重将大鼠腹腔麻醉后，仰卧固定，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，模型组大鼠
用”O”号丝线阻断双侧颈总动脉血流10min，再灌注10min，共间歇阻断双侧颈总动脉血
流3 次，每次间隔10min，同时距鼠尾尖约1cm 处断尾放血2ml，第3 次血流再灌注后观察
75 30min，如大鼠呼吸、心跳平稳，即可缝合皮肤，放回笼中正常饲养。假手术组大鼠仅分离
双侧颈总动脉，不做任何处理。手术大鼠随机分成3 组，即肾阴虚VD 模型组﹢生理盐水组
（简称模型组），肾阴虚VD 模型﹢丹龙醒脑方组（简称丹龙醒脑组），肾阴虚VD 模型﹢
雌二醇组（简称雌二醇组）；假手术组作对照。术后各组大鼠均以正常饮食喂养。术后第
 3d 开始，模型组每日按10ml/kg·d 生理盐水灌胃1 次，雌二醇组每3 天按1mg/kg 腹腔注
80 射苯甲酸雌二醇注射液，丹龙醒脑组按2g/kg·d 灌胃丹龙醒脑方水煎剂；假手术组不做任
何处理。
1.2.2 实验方法
治疗8 周后，取大鼠静脉血，分离血清，在－20℃冰箱保存。将四组大鼠迅速处死后，
取出完整脑组织，用冷生理盐水冲洗后置于冰盘上剥离脑膜，取出海马组织，将一部分海马
85 组织用冷生理盐水将血渍冲洗干净，然后将海马组织常规石蜡切片，厚约4～5μm。
1.2.3 观察指标
取以上标本，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记
法(TUNEL)检测细胞凋亡，免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax 蛋白表达，操作按试剂盒说
明书。在光学显微镜下观察并记录实验结果。
90 1.2.4 统计学处理
采用SPSS17.0 对数据进行统计分析，所有数据用均数±标准差（ x ±S）表示，采用单因
素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐性，用dunnett test；方差不齐时，用秩和检验，
组间比较用Kruskal-wallis H 检验。
2 结果
95 显微镜下观察，各组大鼠海马bax、bcl-2 阳性神经元染色均以胞浆有棕黄色物质沉积为
主，也有部分胞膜及核膜着色，并可显示神经元轮廓。与假手术组比较，模型组凋亡基因
bax 蛋白表达显著增加（P<0.01），抗凋亡基因bcl-2 蛋白表达变化不明显（P>0.05），凋亡
细胞明显增多（P<0.01）。与模型组比较，雌二醇组和丹龙醒脑方组抗凋亡基因bcl-2 蛋白
表达显著增加（P<0.01），凋亡基因bax 蛋白表达降低（P<0.01），凋亡细胞显著减少（P<0.01）。
100 说明雌二醇和丹龙醒脑方能通过抑制bax 蛋白表达，促进bcl-2 蛋白表达，减轻凋亡的发生。
凋亡细胞、bcl-2 蛋白及bax 蛋白
组别 N 凋亡（ x ±S） Bcl-2（ x ±S） bax（ x ±S）
假手术组 16 93.69±26.48 105.12±34.29 110.93±31.30
模型组 14 162.42±19.10* 104.71±33.93 163.57±39.15*
雌二醇组 14 100.78±42.44*Δ 156.35±29.86*Δ 109.64±44.18*Δ
丹龙醒脑方组 15 98..73±24.26*Δ 163.20±30.62*Δ 105.40±35.57*Δ
注：与假手术组比较，*P<0.01，与模型组比较，△P<0.01。
 Bax 蛋白
115 假手术组 模型组
雌激素组 丹龙醒脑组
120
BCL-2
假手术组 模型组
 130 雌激素组 丹龙醒脑组
TUNEL 检测
假手术组 模型组
135
雌激素组 丹龙醒脑组
140 3 分析
近年来研究提示：细胞凋亡是缺血缺氧过程中神经元损伤的一种形式。Gavrieli 等[3]报
道了光镜原位识别凋亡细胞的新方法-----TUNEL 法，即用末端转移酶标记双股DNA 断裂末
端来特异标记核DNA 片段。标记核被特异地染成棕色，普通光学显微镜很易观察。由于其
 重复性和分辨率都较高，且很容易与鉴定损伤细胞类型的其他组织化学染色相结合，使用特
145 别方便，在细胞凋亡的研究中己被广泛采用。TUNNEL 法实际上是分子生物学与形态学相
结合的研究方法，对完整的凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡的最典型的生物
化学和形态学特征，并可检测出极少量的凋亡细胞。
细胞凋亡的发生机制虽然尚未完全明了，但是根据其他组织的模式认为是由于线粒体的
通透性转换释放凋亡诱导因子和细胞色素C（cytochrome C）引起核损伤和凋亡[4]。此外，
150 脑缺血时许多与凋亡有关的基因表达及基因产物均发生改变，参与凋亡的诱导与拮抗作用。
在细胞凋亡的基因调控过程中，Bcl-2 家族成员起着至关重要的作用。Bcl-2 是1984 年
Tsujimoto 等[5]从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因。研究表明原癌基因Bcl-2 是调
节细胞凋亡途径中的一个重要调节基因。Bcl-2 蛋白家族是线虫C（caenorhabdiitis elegans，
C.elegans）中的一类Ced-9 基因产物，能显著抑制细胞死亡的发生，尤其在神经系统。目前
155 已发现了数个Bcl-2 家族成员，它们在结构而非功能上是同类物。通过复杂的进化过程，最
初的Ced-9 基因已进化成具有特殊成员的基因家族，它们中一些可以抑制凋亡，而另一些则
促进凋亡的发生。Bcl-2 家族是重要的神经细胞凋亡调节因子，可以分为两类：一类是抗细
胞凋亡基因，抗凋亡因子bcl-2、Bcl-xl 可抑制细胞凋亡。Bcl-2 是从人淋巴细胞分离出来的
具有阻抑细胞凋亡的1 个原癌基因，它在中枢神经系统中作为一种有效的抑制神经元凋亡和
160 坏死的因子，可促进神经元的存活以及突触的再生。另一类是促细胞凋亡基因，bax、bad
是促进细胞凋亡因子。Bax 蛋白是细胞凋亡的激动剂。
对Bcl-2 基因家族在脑缺血中作用的分析尚处于初级阶段，但却可以证实其在神经元的
生存中起重要作用。体外研究显示：Bcl-2 保护细胞免于各种损伤，包括兴奋性氨基酸毒性，
Ca2+增多，脂质过氧化，自由基损伤等。提示Bcl-2 表达的增加可能对脑缺血后损伤具有保
165 护作用。过量表达Bcl-2 的转基因动物已证实了Bcl-2 的神经保护作用[6]。一些研究分析了
局灶或全脑缺血后Bcl-2 基因家族的促凋亡和抗凋亡成分。保护性蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白
Bax 在神经元凋亡中起重要作用[7]。促凋亡Bax 蛋白在局灶和全脑缺血中对注定死亡的神经
元出现表达增多的现象，而在缺血损伤后恢复的神经元中的表达稳定[8]。局灶和全脑缺血后，
存活神经元均持续表达Bcl-2[9]。Bcl-2 家族成员差异性表达在全脑缺血模型中表现最为显著。
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