降糖益肾方干预胰岛素信号通路改善转
基因2 型糖尿病MKR 鼠肾损伤的
实验研究#
5 成细华1，喻嵘2*
基金项目：国家自然科学基金项目（30973749）；国家教育部博士点基金-新教师类（20094323120001）湖
南省高校创新平台开放基金（09K059）；湖南省中医药科研基金重点项目（2009003）；湖南省科技计划
项目(2010FJ3035); 湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2010-170);湖南中医药大学中西医结合
临床重点学科资助。
作者简介：成细华，（1974-），女，副教授，中医药防治糖尿病及其并发症的防治. E-mail:
chengxihua0309@yahoo.com.cn
（1. 湖南中医药大学中医学院，长沙 410208；
2. 湖南中医药大学科技处，长沙 410208）
摘要：目的 观察降糖益肾方对高脂喂养的MKR 转基因2 型糖尿病小鼠血糖、血胰岛素及肾
皮质中胰岛素受体、磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白表达的影响 方法 选取MKR 鼠40 只经鉴定后，
10 随机分为MKR 鼠组、MKR 鼠高脂组、中药组和西药组。MKR 鼠组用基础饲料喂养，MKR 鼠高
脂组、中药组和西药组用高脂饲料喂养，连续喂养8 周后，中药组给予降糖益肾方，西药组
给予糖适平加贝那普利，同时MKR 鼠组和MKR 鼠高脂组分别给予蒸馏水灌胃4 周。4 周后
收集标本，免疫组织化学SABC 法检测肾小球中胰岛素受体1（IRS-1）、磷脂酰肌醇-3-激
酶(PI-3K)的蛋白表达。结果 降糖益肾方明显降低高脂饮食MKR 鼠肾小球中IRS-1 和PI-3K
15 的蛋白表达水平（与MKR 鼠高脂组比较，P<0.01）。结论 降糖益肾方改善糖尿病肾病系膜
细胞增殖的机制可能与干预胰岛素信号通路有关。
关键词：MKR 鼠；胰岛素信号通路；降糖益肾方；糖尿病肾病
 0 引言
糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的严重慢性并发症，其中肾小球系膜细胞（MCs）增殖、
40 肥大在糖尿病慢性进展性肾病的发展中处于重要地位[1]。胰岛素抵抗（IR）及其所致的β 细
 胞分泌障碍是2 型糖尿病及其并发症发病过程中的两个主要环节，IR 易引起高胰岛素血症。
研究表明，MCs 内存在胰岛素受体底物（IRS），是连接胰岛素 /胰岛素样生长因子(IGF)
信号转导途径上下游的信号分子，胰岛素/IGF 信号途径能够通过激活下游相关蛋白激酶，
促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[2]。本课题组从美国国立卫生研究院(Dr．D．LeRoith)引进的
45 转基因2 型糖尿病MKR 鼠具有高血糖、高胰岛素等特性，为国内2 型糖尿病及其并发症的
研究提供了很好的研究平台[3]。
降糖益肾方由熟地黄、山茱萸、黄芪等药组成，喻嵘等用降糖益肾方治疗转基因2 型糖
尿病MKR 鼠，证明其可以有效改善糖脂代谢，减少尿蛋白，改善肾脏功能[3-5]。本实验以
降糖益肾方对高脂饮食MKR 鼠进行干预治疗，探讨降糖益肾方对高脂饮食MKR 鼠肾小球
50 系膜细胞胰岛素信号通路的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 MKR 小鼠
55 MKR 小鼠(采用组织特异性过度表达转基因技术产生)，由美国国立卫生研究院
(Dr．D．LeRoith)提供MKR 小鼠(纯合子)，经自然交配后繁殖的子代用于实验观察。实验
用小鼠饲养在湖南中医药大学SPF 级实验动物中心。饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按SPF
级实验动物的要求进行制备与消毒。
1.1.2 药物
60 降糖益肾方(滋阴益气活血解毒组方)中药购自湖南中医药大学杏林药房，经鉴定为正品
后，经水煎2 次，合并煎液，过滤浓缩至含生药 1 g/mL，经灭菌后放置于4 ℃冰箱贮存备
用；糖适平（30 mg/片，由北京万辉双鹤药业有限责任公司生产，国药准字:H10940258，批
号:100435）；贝那普利(10 mg/片，由上海新亚闵行药业有限公司生产，国药准字：H20044840，
批号：100501。
65 1.1.3 试剂与试剂盒
末端全血葡萄糖测试条(北京怡成生物技术有限公司，批号 20100424);小鼠胰岛素小鼠
胰岛素ELISA 试剂盒(ADL 公司，产品号QRCT-301330013013EIA\UTL )；通用型SABC 试
剂盒，IRS-1 和PI-3K 鼠抗兔单克隆抗体产自博士德公司。
1.1.4 主要仪器
70 怡成超越(JPS—llI 型)血糖测试仪，北京怡成生物电子技术有限公司提供； 80℃超低温
冰箱产自日本SANYO 公司；石蜡切片机产自Leica 德国。
1.2 方法
降糖益肾方对高脂饮食MKR 小鼠的干预作用 40 只经遗传鉴定的 MKR 小鼠在出
生第 11 w 时剪尾采血进行血糖检测[3]。根据血糖水平、性别分层，随机分为MKR 鼠组、
75 MKR 鼠高脂组、中药组（降糖益肾方组）和西药组（糖适平合用贝那普利），每组10 只。
MKR 鼠组用基础饲料喂养，MKR 鼠高脂组、中药组和西药组均以高脂饲料喂养（高脂饲料
的组成：基础饲料 100%，猪油 15%，胆固醇1%），连续喂养12 周。药物剂量换算按75
 kg 成人体表面积换算。高脂饲料喂养8 周后，中药组以中剂量24.96g 生药.kg-1；西药组以
糖适平（格列喹酮）4.33mg.kg-1，贝那普利1.44mg.kg-1 灌胃，MKR 鼠组、 MKR 鼠高脂
组以蒸馏水灌胃。灌胃容量80 为 0.5 mL/20 g 。每天17:00~18:00 灌胃 1 次，连续给药4 周，
试验中无小鼠死亡。试验结束前天小鼠禁食不禁水5 h 后，以小鼠尾静脉血测血糖浓度。末
次给药后 0.5 h 后，心脏取血，分离血清，-20 ℃冰箱保存备用。同时取小鼠肾脏，4％多
聚甲醛固定后用石蜡包埋，制备常规石蜡切片，用于免疫组化检测。
1.2.1 小鼠血糖和胰岛素测定
85 剪尾采血，以电化学法血糖仪进行血糖检测；血清胰岛素采用采用双抗体夹心ELISA
法，操作严格按照试剂盒说明进行。
1.2.2 免疫组化
免疫组化严格按照试剂说明书进行操作。以细胞内有明显的棕黄色信号颗粒或信号斑为
阳性，不着色为阴性。PBS 取代一抗作阴性对照，已知阳性组织作阳性对照。利用图像分析
90 系统对蛋白表达进行图像分析[4]。
1.3 统计学分析
计量资料以“x
_
±s”表示，方差齐性的采用多组计量资料的方差分析，方差不齐的采用
秩和检验。采用 SPSS 16.0 统计软件 One-way ANOVA 进行处理分析。
2 结果
95 2.1 降糖益肾方对高脂饮食MKR 鼠血糖及胰岛素的影响
与MKR 鼠组比较，MKR 鼠高脂组血胰岛素含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），
而中药组和西药组给药4 周后均能显著降低高脂喂养的MKR 鼠血糖浓度和胰岛素水平（与
MKR 鼠高脂组比较，P＜0.05，P＜0.01），结果见表1。
表1 给药30天后各组鼠血糖及胰岛素含量的变化情况（n=10,x
_
100 ±s）
Table 1 Effect of Jiang tangyishen decoction on fasting blood- glucose and insulin in MKR mice （n=10,x
_
±s）
组别
药物剂量
（g.kg-1）
空腹血糖（mmol/L） 胰岛素(ng/ml)
MKR鼠组 - 8.94±1.71 6.06±0.31▲▲
MKR鼠高脂组 - 9.66±1.46 20.89±1.14
中药组 24.96 7.40±0.75▲ 3.99±0.05▲▲
西药组 4.33/1.44 8.04±1.23▲ 3.54±0.58▲▲
注：与MKR 鼠高脂组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；
▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01 vs the MKR mice high fat group
105 2.2 降糖益肾方对肾小球IRS-1 和PI-3K 蛋白表达的影响
免疫组化结果显示，MKR 鼠组小鼠肾小球仅有微量IRS-1 和PI-3K 蛋白表达，呈棕黄
色；MKR 鼠高脂组肾小球囊壁、系膜区、基底膜可见大量棕黄色阳性颗粒。与MKR 鼠组
比较，MKR 鼠高脂组肾小球IRS-1 和PI-3K 蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P＜
0.01）；给药4 周后，中药组与西药组肾小球及肾小管间质IRS-1 和PI-3K 阳性着色明显减
110 轻（与MKR 鼠高脂组比较，P＜0.01），结果见表2，图1，图2。
 表2 MKR 鼠肾小球IRS-1 和PI-3K 蛋白表达平均光密度的变化（n=5, x
_
±±s）
Table 2 the mean optical density of IRS-1and PI-3K protein expression in the glomeruli of MKR mice
组别 药物剂量
（g.kg-1）
IR PI-3K
MKR 鼠组 - 0.1216±0.0180▲▲ 0.1011±0.0101▲▲
MKR 鼠高脂组 - 0.3810±0.0203 0.4214±0.0251
中药组 24.96 0.1503±0.0097▲▲ 0.1407±0.0047▲▲
西药组 4.33/1.44 0.2946±0.0206▲▲ 0.2759±0.0091▲▲
注：与MKR 鼠高脂组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；
▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01 vs the MKR mice high fat group
115
图1：降糖益肾方对MKR 鼠肾小球IRS-1 蛋白表达的影响（SABC 法，X400）
注：A. MKR 鼠组；A1. MKR 鼠高脂组；A2. 中药组；A3. 西药组
120 Fig.1 Effect of Jiang tangyishen decoction on the expression of IRS-1 protein in MKR mice
A. the MKR mice group；A1. the MKR mice high fat group；A2. traditional Chinese medicine group；A3. the
western medicine group
125
图2：降糖益肾方对MKR 鼠肾小球PI-3K 蛋白表达的影响（SABC 法，X400）
注：B. MKR 鼠组；B1. MKR 鼠高脂组；B2. 中药组；B3. 西药组
Fig.2 Effect of Jiang tangyishen decoction on the expression of PI-3K protein in MKR mice
A. the MKR mice group；A1. the MKR mice high fat group；A2. traditional Chinese medicine group；A3. the
130 western medicine group
3 讨论
糖尿病在中医称为消渴，最早见于《内经》，《灵枢·五变》中指出:“五脏皆柔弱者，
善病消瘅”。消渴病日久容易出现虚劳、水肿、尿浊等症状，因此糖尿病肾病(DN)归属中
135 医学“消渴病”、“虚劳”、“水肿”、“尿浊”、“关格”等范畴。病因与先天察赋不足、
饮食不节、情志失调、劳倦过度、肾元亏虚等因素密切相关；本病病机为本虚标实之证，本
虚是指阴阳、气血、脏腑亏虚，标实是指兼夹瘀血、水湿、痰饮、浊毒等，基本病机为肾虚
血瘀。本课题组根据DN 发病的特征，结合中医“病证结合”理论模式，以滋阴益气、活血
解毒立法，将明代著名医家张景岳的左归丸加减化裁组成降糖益肾方，取得良好疗效[5]。
140 DN 是糖尿病全身微血管病变在肾脏的表现，肾小球系膜细胞（MCs）增殖、肥大在糖
尿病肾病的发展中处于重要地位。MCs 具有多种生理功能，并可产生多种细胞外基质，参
与肾小球基底膜（GBM）的修复与更新等。正常情况下MCs 不增殖，但在胰岛素抵抗及高
血糖、高胰岛素、氧化应激，炎症刺激等多种因素作用下可致MCs 发生异常增殖， 同时伴
A A A2 A3
B B1 B2 B3
 有GBM 增厚和细胞外基质（ECM）堆积[1]。DN 早期与GBM 增厚、蛋白尿密切相关；DN
145 晚期引起ECM 积聚，可致肾小球硬化与间质纤维化，后两种是各种原发性肾病或者继发性
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