淫羊藿苷对人牙周膜细胞OCN 表达水平的
影响
赵弼洲，田佳灵，余占海**
作者简介：赵弼洲，(1985-)，男，硕士研究生，主要研究方向:天然药物治疗口腔疾病方面的研究。
通信联系人：余占海，（1964-），男，教授，主要研究方向：天然药物治疗口腔疾病及口腔修复美学研究.
E-mail: KQyuzhanhai@163.com
5 （兰州大学口腔医学院，兰州 730000）
摘要：目的：探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素（OCN）表达水平的影响，为淫羊藿苷在
治疗牙周病方面的应用提供一定依据。方法：体外培养人牙周膜细胞，矿化诱导条件下将第
3 代细胞与10~0μg/ml，6 个浓度的淫羊藿苷作用，Elisa 测定OCN 表达水平，反应其对人
牙周膜细胞骨向分化的影响。结果：人牙周膜细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作
10 用72h 后，1~0.01μg/ml 组的OCN 表达水平均较对照组显著增加（P＜0.05）。10μg/ml
组OCN 表达水平较对照组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：淫羊藿苷在一定浓度
范围内可促进人牙周膜细胞骨向分化。
关键词：人牙周膜细胞；淫羊藿苷；骨钙素
 0 引言
淫羊藿苷（icariin,ICA）是植物淫羊藿茎叶中提取的总黄酮的主要有效成分。已有研究
证实其可促进成骨细胞增殖，并可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化[1,2]。人牙周膜细胞
35 是一个混杂细胞群，其中的骨向分化亚群及未分化间充质细胞细胞可在一定条件下增殖分化
形成牙骨质或牙槽骨，这是牙周修复再生的重要基础[3,4]。骨钙素（osteocalin,OCN）是细胞
矿化过程中表达的标志性蛋白，由成骨细胞产生，可反映成骨细胞的活跃程度[5]。本实验通
过研究淫羊藿苷对原代培养人牙周膜细胞OCN 表达水平的影响，为其在治疗牙周病方面的
应用提供一定理论依据。
 40 1 材料与方法
1.1 材料与仪器
淫羊藿苷（中国药品生物制品检定所，批号：110737-200415）；高糖DMEM 培养基
（Gibco，美国）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，美国）；
SP-9002 免疫组化染色试剂盒（ZYMED，美国）；波形丝蛋白抗体、角蛋白多克隆抗体、
45 DAB 显色液（北京中杉金桥生物有限公司）；抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松（Sigma，
美国）；茜素红S(上海生工生物技术公司)；人骨钙素Elisa 试剂盒（R&D，美国）；二氧
化碳恒温培养箱（Heraeus，德国）；YJ-8175 型超净工作台（苏州净化设备厂）；倒置相差
显微镜（Olympus，日本）；Powerwave X 自动酶标分析仪（Bio-Tek，美国）。
1.2 人牙周膜细胞原代培养及鉴定
50 选择12 至14 岁正畸患者减数拔除的健康前磨牙，在超净工作台内，用无血清含双抗的
DMEM 冲洗4-5 遍。手术刀片刮取根中1/3 牙周膜组织，置于离心管内，滴加少量0.25%胰
蛋白酶使离心管内组织完全浸没，37℃消化10min，加入含10%胎牛血清的完全培养液终止
消化。800 转离心5min，弃去上清，留少量培养液。将残留的少量培养液与组织块一同吸出，
转移至35mm 培养皿，将组织块在培养皿底分散摆放，缓慢将盖玻片覆盖组织块，使培养液
55 充盈于组织与盖玻片之间。添加培养液2ml，将培养皿置二氧化碳培养箱静置培养，隔天观
察。每3d 半量换液，待细胞生长铺满80%培养皿，消化后按1:3 传代。选取第2 代细胞按
SP 法细胞免疫化学染色，鉴定细胞来源。
1.3 茜素红染色
取第2 代人牙周膜细胞消化后轻轻吹打为细胞悬液，计数以5×104/ml 密度接种于2 块
60 6 孔板，每孔2ml，培养24 小时待细胞贴壁后弃去培养液。一块加入DMEM 矿化诱导培养
液（含5%胎牛血清，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/ml 抗坏血酸，1×10-8mol/L 地塞米松）
2ml。另一块6 孔板加入含5%胎牛血清的DMEM 培养液培养，作为对照组。每3 天半量换
液一次，培养21 天。行茜素红染色，观察矿化结节。
1.4 淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素（OCN）表达水平的影响
65 将第3 代人牙周膜细胞消化后以5×104/ml 接种于24 孔板，待细胞铺满24 孔板底80%
后弃去培养液，按药物浓度分为6 组，每组4 孔，分别加入含10、1、0.1、0.01、0.001、0μg/ml
淫羊藿苷的DMEM 矿化诱导培养液每孔1ml，继续培养。72h 后吸取培养液上清，低温3000
转20min 离心后分装，按人骨钙素Elisa 试剂盒说明进行操作，各浓度样本设6 个复孔，在
酶联免疫检测仪450nm 处检测各样本孔吸光度值。以标准物的吸光度值和浓度绘制标准曲
70 线，根据标准曲线将各样本吸光度值计算出样本浓度。
1.5 统计学处理
实验数据以x ± s 表示，运用SPSS13.0 软件进行单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有
统计学意义。
 2 实验结果
75 2.1 人牙周膜细胞形态学观察
培养4 天左右，组织块周围可观察到细胞游出。细胞呈梭形，胞核清晰，折光性好（图
1）。到10 天，组织块周围多处有细胞游出，细胞数量明显增多，在组织块边缘呈放射状、
螺旋状走形（图2）。
80
图1 组织块周围出现细胞（×100） 图2 细胞呈放射状、旋涡状走形（×100）
Fig.1 Cells grew around the tissue（×100） Fig.2 Cells showed radial and spiral shape （×100）
2.2 细胞鉴定
85 原代培养人牙周膜细胞免疫细胞化学染色，波形丝蛋白染色阳性，表现为胞质棕黄色着
色；角蛋白染色阴性，未见着色（图3~4）。说明是中胚层来源细胞。
图3 波形丝蛋白染色阳性（×400） 图4 角蛋白染色阴性（×400）
90 Fig.3 Positive expression of vimentin（×400） Fig.4 Negative expression of keration（×400）
2.3 茜素红染色
随培养时间增长，细胞密度均逐渐增大，呈旋涡状复层生长。行茜素红染色后可见，矿
化诱导培养组形成多处红染矿化结节，而对照组仅可见到极少数红染矿化结节（图5~6）。
95 说明原代培养的人牙周膜细胞可在矿化诱导条件下骨向分化，并形成细胞外矿化结节。
 图5 矿化诱导培养液培养（×100） 图6 DMEM培养液培养（×100）
Fig.5 Cultured with mineralization induce meium（×100） Fig.6 Cultured with DMEM（×100）
100
2.4 淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素（OCN）表达水平的影响
人牙周膜细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作用72h 后，1~0.01μg/ml 组的
OCN 表达水平均较对照组显著增加（P＜0.05），0.001μg/ml 组的OCN 表达水平较对照组
高，但无统计学意义（P＞0.05）。10μg/ml 组OCN 表达水平较对照组低，差异有统计学意
105 义（P＜0.05）（表1）。
表1 淫羊藿苷对人牙周膜细胞OCN 表达水平的影响（A450， x ± s ，ng/ml）
Tab.1Effect of icariin on the expression of OCN in human periodontal ligament cells（A450， x ± s ，ng/ml）
组别 药物浓度（μg/ml） 72h（ng/ml）
淫羊藿苷组 10 206.448±15.079*
1 291.487±4.586*
0.1 611.919±12.396*
0.01 368.685±18.132*
0.001 262.677±9.791
对照组 0 253.260±6.529
*与对照组比较P＜0.05
110
3 讨论
牙周组织由牙龈、覆盖牙根的牙骨质、牙槽骨和牙周膜构成。牙周膜是一种非矿化的包
围和支持牙齿的结缔组织，位于牙骨质与牙槽骨内壁之间。牙周膜细胞在正畸牙移动过程中
及牙周病或外伤所致牙周破坏的再生与修复中起了重要作用[6-8]。牙周膜细胞是一个包含不
115 同分化阶段和不同功能细胞的异质性细胞群。Seo 等[9]研究发现，牙周膜细胞中存在一种具
有高增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，这种细胞可在体内形成牙周膜/牙
骨质样组织。同时研究发现，在不同的培养条件下，这种细胞可分化为成牙骨质样细胞、成
骨细胞、脂肪细胞以及胶原蛋白形成细胞[10,11]。有学者研究证实牙周膜细胞一定条件下体外
培养可形成矿化结节，并表达成骨相关蛋白，如碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨钙素等[12-14]。实
120 验中将原代培养的人牙周膜细胞在矿化诱导条件下培养21 天后，行茜素红染色，可见有红
染的矿化结节形成，说明其在一定条件下，人牙周膜细胞可骨向分化。一般认为，形成骨样
矿化结节需要经历三个阶段：增殖期，细胞外基质成熟期以及矿化形成期[15]。
淫羊藿苷是中药淫羊藿中提取的黄酮类天然药物，具有抗肿瘤、增强免疫功能、改善心
脑血管功能、调节内分泌等多重药理作用[16]。已有体外研究证实，淫羊藿苷可抑制破骨细
125 胞分化及其功能，还可促进骨髓基质干细胞骨向分化[17-18]。OCN 是成骨细胞的特征性表型
 之一，其由成骨细胞产生。其主要功能包括促进骨的正常矿化，调节矿化成骨过程[5]。Shurl
等研究证实OCN 是牙体硬组织中一种重要的非胶原蛋白，牙周膜细胞也可合成分泌OCN，
并能促进牙槽骨和牙骨质的矿化，是牙周组织修复再生的重要机制[19]。实验中将人牙周膜
细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作用72h 后，Elisa 法检查OCN 表达水平发现，
130 1~0.01μg/ml 组的OCN 表达水平均较对照组显著增加（P＜0.05），但不呈现浓度依赖性。
10μg/ml 组OCN 表达水平较对照组低（P＜0.05），可能是药物毒性抑制了细胞增殖与分化。
4 结论
本文说明人牙周膜细胞具有骨向分化的能力，而一定浓度的淫羊藿苷可以促进其骨向分
化。通过研究淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响，可以为其在促进牙周组织修复
135 再生方面的应用研究奠定一定的基础，但其具体作用机制仍不明确，有待进一步研究。