异氟烷单独或联合咪达唑仑对7 日龄大鼠
大脑Caspase-3 的影响
燕琳，桂伶俐，张传汉**
作者简介：燕琳，（1984-），女，在读研究生，重症监测与脑保护。
通信联系人：桂伶俐，（1977-），女，主治医师，重症监测与脑保护. E-mail: gui_lingli@hotmail.com
5 （华中科技大学附属同济医院麻醉学教研室，武汉 430030）
摘要：目的 观察异氟烷和咪达唑仑对7 日龄大鼠大脑caspase-3 表达的影响。方法 7 日龄
SD 大鼠39 只，随机分为对照组(C 组,n=13)，异氟烷组(I 组,n=13)和咪达唑仑联合异氟烷
组（MI 组,n=13）。C 组：腹腔注射0.9%生理盐水10ml/kg，吸入30%O2 6 h；I 组：在37
℃恒温并通入1.5%异氟烷的麻醉小室内维持麻醉6h ；MI 组：腹腔注射咪达唑仑9 mg/kg
10 后，随即置于37℃恒温并通入1.5%异氟烷的麻醉小室内维持麻醉6h。麻醉结束即刻每组取
3 只大鼠,行动脉血气分析。麻醉结束2h 采用Realtime-PCR 方法检测皮质和海马组织
Caspase-3 mRNA 水平的变化；并用免疫组织化学SABC 法检测大脑Active caspase-3 阳性
神经细胞的分布情况,计数阳性细胞。结果：⑴ I 组和MI 组大鼠麻醉结束即刻动脉血气分
析结果与C 组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。⑵ Realtime-PCR 结果显示，I 组与MI 组
15 大鼠皮质和海马区Caspase-3 mRNA 与对照组相比表达增多，且MI 组与I 组比较Caspase-3
mRNA 表达增加(P<0.05)。 ⑶免疫组化结果也显示：与对照组相比，I 组与MI 组大鼠在皮质、
海马及丘脑部位Active caspase-3 阳性神经细胞数量均明显增多 (P<0.05)，而MI 组与I
组相比，在海马和丘脑部位Active caspase-3 阳性神经细胞数量明显增多(P<0.05)。结论 异
氟烷麻醉能诱导脑发育高峰期大鼠重要脑区Caspase-3 表达增加，联合应用咪达唑仑增加更
20 明显；推测Caspase-3 表达增加可能引起凋亡级联反应，导致神经细胞凋亡增加。
关键词：异氟烷；咪达唑仑；细胞凋亡；caspase
 0 引言
在哺乳动物脑发育高峰期，也称为突触发生期，易受到各种干扰因素的影响。N-甲基-D-
天(门)冬氨酸(NMDA)和γ-氨基丁酸(GABA)是CNS 两大重要的神经递质，参与形成神经细
55 胞的化学微环境，在CNS 发育和稳定中起着重要作用。目前临床上常用的全麻药包括具有
NMDA 受体拮抗活性（氯胺酮、N2O 及氙气）和GABAA 受体激动活性（巴比妥类，咪达唑
仑，丙泊酚等）及两者兼具的药物（吸入麻醉药异氟烷、七氟烷等），通过调节配体门控离
子通道改变突触功能，发挥麻醉效应[1]。突触发生期在人类出生前3 个月到出生后2 至
3 年，即妊娠晚期至婴幼儿时期；而在哺乳动物如大鼠主要是出生前1、2 天至出生后2 周[2]，
60 其中7 日龄（P7）被认为是大鼠脑发育最高峰期。在此时期使用该类药物对突触发生期大脑
发育是否存在毒性作用逐渐引起人们的广泛关注。因此，本研究将临床常用麻醉药异氟烷和
咪达唑仑作用于P7 大鼠，拟观察异氟烷单独或联合咪达唑仑对其大脑caspase-3 表达的影响，
探讨异氟烷与咪达唑仑致发育期大鼠的神经毒性作用，为进一步探讨全身麻醉药对新生儿及
婴幼儿脑发育的影响提供实验基础。
65 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
7 日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不拘，体质(13.5-16)g，购自华中科技大学同济医
学院实验动物学中心。
70 1.1.2 主要仪器与试剂
Penlon Prima SP 麻醉机（英国）、i-STAT 血气分析仪（美国）、低温恒冷冻切片机(Leica
CM 1900，德国)和生物显微镜(NIKON TE2000，日本)、Image-proplus 6.0 图像分析软件、实
时定量PCR 试剂盒(Takara 公司，日本)、8453E 型紫外分光光度仪(Agilent 公司，美国)和
LightCycler 实时荧光定量PCR 仪(Roche 公司，美国)；异氟烷（批号876115U, 上海雅培制
75 药有限公司）、咪达唑仑注射液（批号2110401，宜昌人福药业）、多克隆兔抗Active caspase-3
抗体（3015-100，Biovision 公司，美国），免疫组化SABC 试剂盒由武汉博士德公司提供。
1.2 方法
1.2.1 分组及麻醉
分别将39 只7 日龄SD 大鼠随机分为3 组（n=13）：对照组（C 组）：腹腔注射0.9%
80 生理盐水10ml/kg；异氟烷组（I 组）：1.5%异氟烷麻醉6h；咪达唑仑联合异氟烷组（M 组）：
腹腔注射咪达唑仑9mg/kg 后立即置于携带1.5%异氟烷的混合气体维持麻醉6h。参照Lunardi
N 等人[2]的麻醉方法并作改进，使用Penlon Prima SP 麻醉机，连接氧源，在麻醉机输出口接
一导管与麻醉小室的进气口相连，麻醉小室的出口处连一细管与外界通风处相通，形成麻醉
 管路。自制密封麻醉小室置于37℃恒温箱，麻醉小室为长方形，大小为10cm×8cm×8cm。
85 将I 组及MI 组新生鼠置于自制密封麻醉小室内，持续给予携带1.5%异氟烷浓度的含30%氧
气的混合气体（混合气体预充麻醉管路15 分钟）。预实验证实混合后气体经气相色谱仪检
测其携带异氟烷浓度与挥发罐刻度一致。C 组通入仅含30%氧气的混合气体；气体流量为
2L/min。
1.2.2 血气分析
90 麻醉过程中均仔细观察大鼠皮肤黏膜颜色变化，有无缺氧、CO2 潴留等表现。实验中每
隔30min 检测大鼠麻醉深度，采用针刺、尾钳等方法，每次检测时间不超过15 秒。麻醉结
束后各组分别取3 只大鼠，抽取左心室血行血气分析。其余大鼠返回母鼠身边继续喂养。
1.2.3 Real-time PCR 检测caspase-3mRNA 水平变化
麻醉结束后2 小时用Trizol 试剂盒提取各组大鼠脑组织皮质区及海马区的总RNA，紫
95 外分光光度计测定RNA 浓度，按照实时定量RT-PCR 试剂盒说明书取500ng 总RNA 逆转
录合成cDNA，然后以SYBRⅠ作为荧光标记物，在ABI 实时荧光定量PCR 仪上进行PCR
反应。在同一反应体系内对caspase-3 和内参β-actin mRNA进行扩增。PCR 引物为：Caspase-3
上游引物5’-GCAGCAGCCTCAAATTGTTGACTA-3’ ， 下游引物为5’-TGCTCCGG
CTCAAACCATC-3’ ， PCR 产物片段为247bp。β-actin 上游引物为5’-TGACAGGAT
100 GCAGAAGGAGA-3’，下游引物为5’-TAGAGCCACCAATCCACACA-3’，PCR 产物片段为
104bp。扩增分三步：95℃预变性10s，95℃变性8s，60℃退火30s；95℃变性15s，60℃退
火及延伸60s；95℃变性15s。设置反应40 个循环，分析融解曲线。以△Ct 表示Caspase-3
的表达，△Ct = Ct(Caspase-3)一Ct(β-actin)，△Ct 值越高，Caspase-3 的表达越低。
1.2.4 免疫组化检测各组Active caspase-3 的表达
105 麻醉结束后2 小时，将动物经10%水合氯醛（300ml/g）麻醉，快速开胸，暴露肝脏，
用一次性头皮静脉针经左心室插管至升主动脉，先用0.9%生理盐水快速灌注，待右心耳流
出液变成淡红色，肝脏颜色发白时改用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定20min 后完整取脑，
在上述多聚甲醛液中4℃后固定4-12h 后，转入30%蔗糖液中4℃过夜至下沉，从视交叉处
连续做冠状位冰冻切片，片厚15um。每只动物取2 张切片，行Active caspase-3 的免疫组织
110 化学染色。具体操作步骤如下：4%多聚甲醛室温固定15min，0.01M PBS 漂洗5min，3 次。
0.3% TritonX-100 破膜 30min，0.01M PBS 漂洗5min，3 次。10%山羊血清封闭液室温孵育
40min，倾去勿洗，加入兔抗active caspase-3（1:20），放于湿盒内4 度冰箱孵育24h。之后
按照SABC 试剂盒说明完成后续操作。加入适量新鲜配制DAB 显色液，镜下观察控制显色
时间。待出现红棕色染色后立即终止反应。之后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，
115 镜下观察，照相。对每张切片随机选取海马、皮质、丘脑的10 个高倍视野（×400）应用
Image-Pro plus 6.0 软件计算神经细胞染色细胞数，以阳性细胞数表示Active caspase-3 的表
达。
1.2.5 统计学分析
采用SPSS12.0 统计分析软件，计量资料以均数±标准差( ±s)表示，组间差异采用单
120 因素方差分析﹙P＜0.05﹚。
 2 结果
2.1 血气分析
在整个实验过程中，所有大鼠呼吸平稳，I 组与MI 组大鼠皮肤黏膜与C 组大鼠相同，
均呈粉红色。实验中轻微刺激大鼠无反应，较重刺激有缩爪反应。麻醉结束后即刻大鼠左心
125 室血气分析可知无明显的缺氧、CO2 潴留等现象发生（见表1）。
2.2 实时荧光定量PCR
在皮质和海马区，与C 组相比，I 组和MI 组麻醉后2h Caspase-3 mRNA 表达均增高（p
＜0.05）, MI 组和I 组相比，麻醉后2h Caspase-3 mRNA 表达表达增高（p＜0.05）（图1）。
2.3 组织学观察
130 光镜下观察DAB 显色胞浆内棕黄色染色为Active caspase-3 阳性细胞。与C 组相比，与
C 组相比，I 组和M 组在皮质、海马、丘脑部位Active caspase-3 阳性细胞均明显增高（P
＜0.05），与I 组相比，MI 组在海马和丘脑部位Active caspase-3 阳性细胞表达增高（P＜0.05），
但是在皮质部位两组差别无统计学意义（P＞0.05）。以各组海马区Active caspase-3 阳性细
胞为例（图2; ×400）。各组细胞计数结果（见表2）。
135
图1-a 麻醉结束后2h各组大鼠海马区Caspase-3 mRNA的表达
Fig 1-a The expression of Caspase-3 mRNA in hippocampal area of the different three groups at 2h after
anesthesia finished
*P<0.05 compared with control group； # P<0.05 compared with I group
 图1-b 皮质caspase-3 mRNA 相对表达量（n=5， ±s）
Fig 1-bThe expression of Caspase-3 mRNA in cortical area of the different three groups
at 2h after anesthesia finished
*P<0.05 compared with control group；
145
图2 麻醉结束后2h 各组大鼠海马区 Active caspase-3 的表达（×400）（→ 所示）
Fig 2 The expression of Active caspase-3 in the hippocampal area of different three groups
at 2h after anesthesia finished（×400）
150
表1 各组T7 时点新生鼠pH 值、PaCO2、PaO2、 HCO3
- 、BE 和SaO2 的比较（n=5， ±s）
动脉血气 C组 I组 MI组
pH 7.48±0.05 7.49±0.03* 7.48±0.04*
PaO2(mmHg) 118±10 97±11* 98±10*
PaCO2(mmHg) 32±6 29±4* 30±4*
HCO3
- (mmol/l) 23±4.0 22±2.2* 22±2.5*
BE 0.5±3.0 1.05±2.7* 1.04±2.5*
SaO2 (%) 99±1.0 97±1.2* 98±1.0*
(与C 组相比 *P＞0.05)
表2 各组Active caspase-3 阳性细胞数值比较（n=5, ±s）
组别 皮质 海马 丘脑
C 组 28.15±7.154 44.65±5.354 7.70±2.080
I 组 73.30±10.053* 80.90±11.566 * 45.80±5.578 *
MI 组 120.00±27.635 *# 164.30±45.622 ** 147.85±19.578 *#
155 与C 组比较，*P﹤0.05, * *P﹤0.001；
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