芎芷地龙汤对偏头痛风热证
Glu-NMDAR-nNOS 通路的影响#
赵永烈1，王玉来1，姚卓亭2，秦绍林1，高颖3*
基金项目：教育部博士点新教师基金：（200800261023）
作者简介：赵永烈，（1975-），男，医学博士，副主任医师，主要从事中医药治疗神经系统疾病的临床与
实验研究. E-mail: yongy3@126.com
5 （1. 北京中医药大学东方医院，北京100078；
2. 人民卫生出版社，北京 100021；
3. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700）
摘要：目的:探讨偏头痛受风热侵袭后机体发生痛觉敏化的病理机制及芎芷地龙汤对模型的
治疗机理。方法:使用热风及硝酸甘油协同诱导建立大鼠偏头痛风热证模型，观察2h 内搔头
10 次数，用免疫组化法测定三叉神经脊束核GLU、NR2B、nNOS 表达情况。结果: 偏头痛模型组、
偏头痛风热证组2h 内搔头次数明显增多，与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统
计学意义（P＜0.01）；偏头痛模型组、偏头痛风热证组三叉神经脊束核尾部GLU 表达、NR2B
表达、nNOS 表达均明显上调，与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义（P
＜0.01）。结论:风热对正常机体无影响，而对硝酸甘油致偏头痛模型病理状态有显著影响，
15 说明风热外袭致偏头痛痛觉敏化的发生，芎芷地龙汤能明显改善偏头痛动物模型的行为学症
状，减少动物的阳性反应次数，减少三叉神经颈复合体中Glu、NR2B、nNOS 表达。 关键词：偏头痛风热证模型；谷氨酸；一氧化氮合成酶；NMDA 受体；痛觉敏化；芎芷地龙
汤。 0 引言
我们前期实验观察了偏头痛风热证动物模型生物表征：一般情况、舌象、耳廓、结膜等
变化，并使用祛风清热之芎芷地龙汤进行反证以确定模型的证属性[1]，为进一步研究偏头痛
50 受风热侵袭后痛觉敏感化的作用机理，实验从三叉颈复合体中Glu-NMDAR-nNOS 通路方面
探讨偏头痛风热证痛觉敏化的的病理机制。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
清洁级雄性SD 大鼠40 只，体重150-180g，由北京维通利华实验动物研究所提供，合
55 格证号：SCXK(京)2005-0005。适应性饲养三天后随即机分为正常组（n=8）、偏头痛模型
组（n=8）、风热组（n=8）、偏头痛风热证组（n=8）、中药治疗组（n=8）5 组，每组各8
只。动物分笼群养，室内温度21-27℃，相对湿度45%-55%。各组大鼠喂常规饲料，自由进
食饮水。
1.2 药品
芎芷地龙汤（组成：川芎15g 白芷15g 生石膏后下60 30g 地龙20g 元胡10g），饮片均购
于北京中医药大学东方医院药房，自行按常规煎煮法煎煮并浓缩，每毫升含生药1.8g；氯化
钠注射液500ml/袋，北京双鹤药业股份有限公司生产，批号A200909154；硝酸甘油注射液
5mg/mL，北京益民药业有限公司生产，批号20081025。
1.3 主要仪器
65 佳能数码相机PowerShot A710；Image J 1.36b 图像分析软件；恒温冷冻切片机Shandon
Bright-5030；电吹风 PHILIPS HP8200；Imagepro Plus5.0 图像分析软件。
1.4 模型制备与药物干预
实验第1 日开始每日早晨固定时间予风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组电吹风吹热
风，1 档热度，风力1 级，距离约45cm，温度控制于39-41℃，连续吹风7 日，每次2 小时，
70 第8 日灌胃后30min 予偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组皮下注射硝酸甘油
10mg/kg，复制实验性偏头痛动物模型，正常组、风热组则皮下注射等量的生理盐水。实验
第5 日开始灌胃给药，连续4 天，中药治疗组灌胃给芎芷地龙汤（10.8g/kg），其余组均灌
胃等量生理盐水。
1.5 指标观察
75 1.5.1 动物喂养7 日内的一般情况，包括活动情况、皮毛色泽、进食、大便性状。
1.5.2 观察第8 日皮下注射硝酸甘油或生理盐水后各组大鼠行为改变，并计大鼠搔头次
数。
1.5.4 免疫组化法研究大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核中GLU、NR2B、nNOS 蛋白的表达
情况。
80 1.6 灌注、取材、切片
于实验第8 天麻醉采集舌象、耳廓、眼结膜图像后，将大鼠四肢固定置于台上，手术剪
剖开胸腔，经左心室向升主动脉插管后，立即剪开右心耳，迅速以预冷的0.9%氯化钠溶液
 约100 毫升灌流冲洗，直到流出液体变清为止（约10 分钟）；继之灌入预冷的4%多聚甲
醛缓冲固定液（0.1mol/L PB 配置，pH 为7.4）200ml，至四肢颈项变硬，约20 分钟，完整
85 取出鼠脑并置于4%多聚甲醛溶液中4℃后固定12 小时。然后将脑组织移至30%蔗糖溶液中
（0.1mol/L PB 配置，pH 为7.4），待组织下沉后，即可进行冰冻切片。恒冷切片机中（-25
℃）将大鼠脑组织以OCT 包埋，按包薪民，舒思云主编的《大鼠脑立体定位图谱》[2]于前
囟后方10.8-14.6mm 之间连续冠状切片，片厚30μm，隔5 张取一张，切片收集于盛有
0.01mol/L 的PBS（pH7.4）的24 孔板中待染。
90 1.7 免疫组化步骤（SABC 法）
脑片经0.01mol/LPBS 冲洗后用0.5% TritonX-100 37℃孵育30min,以增加膜的通透性;浸
入3%H2O215min 以消除内源性过氧化物酶;10%的正常血清封闭1h;适当稀释的一抗(兔抗
Glutamate、NR2B、nNOS 稀释度均为1:200)室温孵育1h，4℃轻摇过夜;生物素化二抗(1:200)
室温孵育4h;在0.05% DAB 及0.003% H2O2 显色液中显色约5-8min,反应充分即用PBS 中止
95 反应;切片裱于经明胶包被的载玻片上,干燥后脱水、透明,中性树胶封片。各步骤间均用
0101mol/LPBS 冲洗3×10min。阴性对照以正常血清代替一抗。
1.8 图像分析
选取每组冠状切面在三叉神经脊束核尾部的切片进行照相，图像用Imagepro Plus5.0 图
像分析系统分析，GLU 与nNOS 计算累积光密度（IOD sum），NR2B 计算视野中阳性细胞
100 数。
1.9 统计学处理
应用SPSS16.0 统计学软件进行数据处理，所有数据均用均数±标准差（ X ±S）表示，
对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，若两项检验均符合，单因素方差分析（One-way
ANOVA）统计，组间比较采用SNK 检验，对不满足任一检验的数据，采用非参数检验中
105 的多个独立样本Kruskal-Wallis H 检验，组间比较采用Mann Whitney U 法检验，均以P＜0.05
作为差异有统计学意义的界限。
2 结果
2.1 大鼠一般情况观察
各组大鼠在饲养期间均毛发光洁整齐，食欲可，行动灵活敏捷。
110 风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组在吹热风时均有部分大鼠出现烦躁、笼内站立、
跳跃，鼻出血的情况。
实验开始吹风处理前观察各组大鼠大便，多为软便、中等质地或偏硬质润，开始吹风后，
风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组大鼠大便无软便，少见中等质地，多为偏硬质润或干
硬便，而正常组与偏头痛模型组以中等便及偏硬质润便为多。
115 2.2 偏头痛风热证实验动物模型行为变化
偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组皮下注射硝酸甘油后5min 出现烦躁，活
动增多，前肢及后肢频繁搔头，双耳耳廓血管较正常组增粗，且血管增长直抵耳缘，中药治
疗组烦躁、搔头的表现较偏头痛模型组及偏头痛风热证组少，三组在1h 时基本安静蜷卧，
其后间断活动，以蜷伏为主。
 120 搔头次数计数:以前肢搔脸一次计一次，后肢快速搔头动作从开始到停止计一次，人工
观察计算每只大鼠皮下注射后至2h 的搔头次数，以判断实验模型复制是否成功。结果见表
1。
偏头痛模型组2h 内搔头次数与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义
（P＜0.01）；偏头痛风热证组2h 内搔头次数与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有
125 统计学意义（P＜0.01）；正常组与风热组2h 内搔头次数相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；
偏头痛风热证组与偏头痛模型组2h 内搔头次数相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
表1 各组2h 内搔头次数（ X ±S，n=8）
组别 搔头次数
正常组 13.13±3.66▲▲**
风热组 16.25±5.04▲▲**
偏头痛模型组 78.25±12.8##
偏头痛风热证组 87.00±10.78##
中药治疗组 51.00±14.42##▲▲**
与正常组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；
与偏头痛模型组比较：▲P＜0.05，▲▲130 P＜0.01；
与偏头痛风热证组比较: *P＜0.05，**P＜0.01。
2.3 芎芷地龙汤对三叉神经脊束核尾部GLU 表达、NR2B 表达、nNOS 表达的
影响
135 三叉神经脊束核GLU 表达、NR2B 表达、nNOS 表达结果见表2、图1、2、3。
①GLU 染色为棕褐色，位于胞浆和细胞核。偏头痛模型组三叉神经脊束核尾部GLU 表
达与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；偏头痛风热证组
三叉神经脊束核尾部GLU 表达与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义（P
＜0.01）；正常组三叉神经脊束核尾部GLU 表达与风热组、中药治疗组相比，无显著差异
140 （P＞0.05），偏头痛风热证组与偏头痛模型组三叉神经脊束核尾部GLU 表达相比，差异无
统计学意义（P＞0.05）。
②NR2B 染色为棕褐色，位于胞浆。偏头痛模型组三叉神经脊束核尾部NR2B 表达与正
常组、风热组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；偏头痛风热证组三叉神经脊束核尾部
NR2B 表达与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；正常组
145 三叉神经脊束核尾部NR2B 表达与风热组相比，无显著差异（P＞0.05），偏头痛风热证组
与偏头痛模型组三叉神经脊束核尾部NR2B 表达相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
③nNOS 染色为棕褐色，位于胞浆。偏头痛模型组三叉神经脊束核尾部nNOS 表达与正
常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；偏头痛风热证组三叉神
经脊束核尾部nNOS 表达与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；
150 正常组三叉神经脊束核尾部nNOS 表达与风热组、中药治疗组相比，有显著差异（P＜0.01），
偏头痛风热证组与偏头痛模型组三叉神经脊束核尾部nNOS 表达相比，差异无统计学意义（P
＞0.05）。
 表2 三叉神经脊束核尾部GLU 表达（ X ±S，n=8）
组别 GLU 累积光密度 NR2B 阳性细胞数 nNOS 累积光密度
正常组 188075.42±51115.21▲▲** 28.6±5.8▲▲** 134428.9±60711.4▲▲**
风热组 198163.66±56686.51▲▲** 32.0±5.7▲▲** 176443.2±57206.32▲▲**
偏头痛模型组 261800.82±44308.69## 41.8±6.9## 2371984.2±71068.2##
偏头痛风热证组 277604.84±38343.63## 45.4±6.1## 2387126.0±73227.74##
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