PPAR-γ激活对血管平滑肌细胞外基质
释放及CTGF 表达的影响#
高登峰，牛小麟，郝广华，魏瑾，孟哲*
基金项目：国家自然科学基金（No 30900617，No 81070219），教育部博士点基金新教师基金（No
2008.6981036），陕西省科技攻关项目（No 2007K13-03(13)），国家重点研究发展基础计划（973）（No
2011CB503904）。
作者简介：高登峰，（1978-），男，主治医师，博士，主要研究方向，心血管重构. E-mail: gaomedic@163.com
5 （西安交通大学医学院第二附属医院心内科，西安 710004）
摘要：目的：观察体外培养条件下，PPAR-γ激活对血管紧张素II 诱导的大鼠血管平滑肌细
胞外基质（ECM）释放及结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。方法：原代培养大鼠血管
平滑肌细胞，用不同浓度PPAR-γ激动剂rosiglitzone 和/或抑制剂GW9662、BADGE 预处理
后，加入血管紧张素II（Ang Ⅱ）(10-7mol/L)刺激24h。比色法检测各组细胞培养液中羟
10 脯氨酸含量，实时荧光定量RT-PCR 方法检测各组三型胶原（Col III）、层粘连蛋白（FN）
及CTGF mRNA 表达，westernblot 检测各组CTGF、PPAR-γ蛋白表达情况，基于ELISA 的
DNA-binding 检测各组PPAR-γ活性。结果：Ang II 可增加VSMCs PPAR-γ表达，但明显抑
制其活性（P<0.05, vs. Control），PPAR-γ激动剂rosiglitazone 可显著增加PPAR-γ蛋
白表达及活化（P<0.05, vs. Ang II）。rosiglitazone 可降低细胞培养液中羟脯氨酸含量，
15 下调VSMCs 中Col III、FN、CTGFmRNA 表达，抑制CTGF 蛋白表达，而其他PPAR-γ激动剂
（pioglitazone、15-d-PGJ2）均有相似作用，PPAR-γ拮抗剂GW9662 及BADGE 可拮抗这一
作用。结论：在VSMCs 中， PPAR-γ激活可抑制Ang II 诱导的CTGF 表达，同时抑制ECM
沉积。提示PPAR-γ可能在血管纤维化中起重要作用。
关键词：血管紧张素；细胞外基质；CTGF；PPAR-γ
 0 引言
血管纤维化以细胞外基质（ECM）紊乱性分布为特点，是高血压及糖尿病的主要并发
症之一[1, 2]。越来越多的研究表明，血管紧张素II（Angiotensin II， Ang II）在血管纤维化
中起重要作用。Ang II 系统性输注可引起实验动物血管纤维化[3]，而阻断AngII 信号通路可
50 在糖尿病、肾切除及NO 缺乏小鼠中抑制血管纤维化[4]。在与其受体结合后，Ang II 可激动
下游多条信号转导通路，从而诱导血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle cells，VSMCs）
细胞增殖、凋亡以及迁移，导致血管炎症并促进ECM 重排，最终导致血管纤维化[5]。PPAR-γ
属核受体超家族成员，当被其配体激活后，PPAR-γ 可与RXR 受体结合，形成异源二聚体，
识别靶基因启动子序列内的PPAR 反应原件。从而调控基因表达[6]。研究表明，PPAR-γ 具
55 有潜在的抗心血管纤维化作用。在体实验表明，PPAR-γ 激动剂TZDs 类药物在心梗后大鼠、
AngII 系统性输注大鼠中均具有抗心肌纤维化的作用[7]，但其机制不明。考虑到VSMCs 是
AngII 致血管损伤的主要靶细胞，且CTGF 是AngII 致血管纤维化的重要下游因子[8]，本研
究拟观察PPAR-γ 激活对Ang II 诱导ECM 释放及CTGF 表达的影响。探讨PPAR-γ 在血管
纤维化中的可能机制。
60 1 材料与方法
1.1 试剂
DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素以及TRIzol 购自Gibco Brl (Carlsbad, CA)；
Ang II, 15-deoxy-delta12,14-prostaglandin J2 (15-d-PGJ2), GW9662 以及bisphenol A diglycidyl
ether (BADGE) 购自Sigma(St. Louis, MO, USA). PPAR-γ 激动剂Rosiglitazone、 pioglitazone
65 购自Alexis (Lausen, Switzerland). 兔抗鼠CTGF 抗体购自购ABCAM (Cambridge, UK). 兔抗
鼠PPAR-γ 抗体购自UPSTATE Inc. (Chicago, IL, USA). ColIII、FN 购自Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA,USA)。
1.2 细胞培养
取SD 大鼠胸主动脉，按文献报道[8]采用胶原分解法分离VSMCs，并在含有10%FBS
70 的DMEM 培养基中传代培养，取3~7 代培养细胞，经α-SMA 免疫组化染色鉴定，纯度达
99%。在进行实验时，使细胞长至融合80%，再经无血清培养48 h 后用于试验。
1.3 分组
药物干预细胞分为5 组（每组n=3）A 空白对照组（control 组，不加药物干预）；B 组
为Ang II 刺激组（Ang II 作用24 h）；C 组为Ros＋AngII 组，即rosiglitazone(10-6mol/L、
75 10-5、10-7mol/L)预孵育1 h 后，加入10-7mol/L 的AngII 继续培养24 h；D 组为PPAR-γ 激动
剂组，即pioglitazone、15d-PGJ2 预孵育2 h 后，加入10-7mol/L 的Ang II，继续培养24 h。
E 组为PPAR-γ 拮抗剂组，即GW9662、BADGE 预孵育1h，加入Rosiglitazone 预孵育2h，
最后加入10-7mol/L 的Ang II 继续培养24 h。
1.4 细胞培养液中羟脯氨酸含量的测定
80 羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，而在其它蛋白中均不存在，
因此测定细胞培养液中羟脯氨酸的含量，可间接反应细胞胶原蛋白释放情况。根据羟脯氨酸
在氧化剂的作用下产生氧化产物与二甲基苯甲醛作用呈现紫红色的原理，测定细胞培养上清
 液中羟脯氨酸的含量。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，具体方法见说明书。细
胞培养液中羟脯氨酸含量计算见下：
羟脯氨酸含量=
标准管吸光度空白管吸光度
测定管吸光度空白管吸光度
−
−
×
取样量
标准管含量× 水解液总体积
85
1.5 实时定量RT-PCR
采用TRIzol 试剂分离总RNA，用Super-ScriptTM III Platinum1 Two-Step qRT-PCR kit
(Invitrogen, Carlsbad, CA)试剂盒在ABI PRISM 7000 sequence detection PCR system (Applied
Biosystems, Foster City, CA) 上行实时定量 RT-PCR Primers。扩增所需大鼠PPAR-γ, AT1,
90 CTGF,fibronectin (FN), type III collagen (Col III) and glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH) 序列见表1。以 GAPDH 作为内参照。结果表示为每种基因与
GAPDH 的比。 为了保证PCR 准确性，绘制每个基因的标准曲线。应用溶解曲线检测保证
扩增产物的特异性。
1.6 免疫印迹
95 用冰的细胞裂解液(50 mMHEPES, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, pH 4)
裂解细胞，裂解液中常规加入蛋白酶抑制剂及磷酸化抑制剂(50 mM sodium fluoride, 1 mM
sodium orthovanadate, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 nM microcystin)。采用BCA 蛋白定量
试剂盒 (Pierce, Rockford, IL)测定样品蛋白浓度。 取20μg 样品，经10% SDS-PAGE 胶分离
后，转膜至(PVDF) 膜上。一抗孵育浓度如下PPAR-γ (1:500), CTGF (1:1000)及β-actin
100 (1:500)。以β-actin 作为内参照。采用化学发光经X 片曝光观察信号强弱。最后用Gel Doc 2000
(Bio-Rad)分析条带的光密度。以β-actin 作为内参校正各组蛋白表达情况。
1.7 DNA-binding 分析
采用Pierce NE-PER kit(Pierce)分离核蛋白。 PPAR-γ DNA-binding 活性采用基于ELISA
法的PPAR-γ 转录活性测定试剂盒测定 (Cayman Chemical, USA)。具体步骤如下：取10μg
105 核蛋白加入事先包被有PPAR 特异性双链DNA 结合位点的96 孔板上，4℃孵育过夜。结合
的PPAR-γ 经特异的PPAR-γ 标记显色后检测。
1.8 统计学分析
各组数据均采用x ±SE 表示，用SPSS12.0 统计软件进行统计，进行单因素方差分析、
ｑ检验，P<0.05 表示差异有显著性。
110 2 结果
2.1 Ang II 及PPAR-γ 激动剂对PPAR-γ 表达及活性的影响
我们的结果显示，与control 组相比，Ang II (1.0×10－7 mol/L) 作用24h 后，VSMCs
PPAR-γ mRNA 及蛋白表达水平显著增高（P<0.05）（如图1 所示），与此同时PPAR-γ 活
性却明显降低（P<0.05, vs. Control）（如图2 所示）。与Ang II 组比较，rosiglitazone 5.0×10
115 －6 mol/L 预处理1 h（Ros 组）则显著增加了VSMCs PPAR-γ 蛋白表达及活化（P<0.05）
（如图1,2 所示）。
 2.2 PPAR-γ 激活对细胞培养液中羟脯氨酸含量的影响
我们测定了各组细胞培养液中羟脯氨酸含量，以此来表示胶原合成情况。如表2 所示，
Ang II 组细胞上清液中的羟脯氨酸含量显著高于对照组（P<0.05），表明1.0×10-7 mol/L Ang
II 处理24 h 可显著增加VSMCs 120 胶原分泌。与Ang II 组比较，rosiglitazone 预处理1 h（1.0×10
－6、5.0×10－6、10.0×10－6 mol/L）可呈剂量依赖性减少VSMCs 胶原分泌（P<0.05），而
PPAR-γ 拮抗剂GW9662 可显著抑制rosiglitazone 的这一作用。此外，rosiglitazone 5.0×10－
6mol/L 单独作用24 h 对VSMCs 基础胶原分泌无显著影响（P>0.05）。
2.3 PPAR-γ 激活对Col III、FN 及CTGF mRNA 的表达
125 如图3 所示，与control 组相比，Ang II 1.0×10－7 mol/L 处理24 h 后显著增加了VSMCs
内CTGF、Col III 及FN mRNA 的表达（P<0.05）。而rosiglitazone 预处理1 h（1.0×10－6、
5.0×10－6、10.0×10－6 mol/L）可呈剂量依赖性抑制上述变化（P<0.05, vs. Ang II）。而
rosiglitazone 对VSMCs 基础Col III 及FN mRNA 表达无显著影响（P>0.05）。
2.4 PPAR-γ 激活对CTGF 蛋白表达及释放的影响
130 应用western blotting 技术，我们研究了rosiglitazone 对Ang II 诱导CTGF 蛋白表达及分
泌的影响。如图4 所示，我们发现正常对照组VSMCs 及其条件培养基中，CTGF 蛋白表达
量很低。而与control 组比较，Ang II 1.0×10－7 mol/L 处理24 h 则可显著上调VSMCs 内及
条件培养基中CTGF 蛋白含量（P<0.05）。经rosiglitazone 不同浓度预处理1 h（1.0×10－6、
5.0×10－6、10.0×10－6 mol/L）则呈剂量依赖性显著抑制了Ang II 的这一效应（P<0.05, vs.
135 Ang II）。
如果PPAR-γ 激活参与了rosiglitazone 对Ang II 诱导的CTGF 表达的抑制作用，则其它
PPAR-γ 激动剂也应该存在相似的生物学效应，且PPAR-γ 拮抗剂应该对上述效应起拮抗作
用。为了验证这一假说，我们改用PPAR-γ 的天然配体15-d-PGJ2 （5.0×10-6 mol/L ）及另
一种人工合成的PPAR-γ 配体pioglitazone（50×10-6 mol/L ）对VSMCs 分别进行了1 h 的预
140 处理，而后用Ang II (1.0×10-7 mol/L)刺激24 h。通过应用实时定量RT-PCR 及免疫印迹技
术我们发现，与Ang II 比较，15-d-PGJ2 及pioglitazone 预处理组CTGF mRNA 及蛋白表达
均显著下调（P<0.05），（如图5）。而PPAR-γ 拮抗剂GW9662 及BADGE 均可不同程度
拮抗rosiglitazone 对CTGF 表达的抑制作用（P<0.05, vs. Ang II＋Ros）。以上结果高度提示，
PPAR-γ 的活化至少部分参与了rosiglitazone 对Ang II 诱导的CTGF 表达的抑制作用。
 图1. Ang II 及rosiglitazone 对VSMCs PPAR-γ 表达的影响。A：各组VSMCs PPAR-γ mRNA 表达情况；
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