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270 （1）LGEC-ZsGreen1DR 细胞株具有良好的反应性：本研究所建立的LGEC-ZsGreen1DR 细胞株能否作为抗干眼症药物高通量筛选体系，关键在于其是否能有效监测外源物质或 TGF-β1 作用后的活性变化。本研究通过TGF-β1 评价了LGEC-ZsGreen1DR 细胞对Sp-1 蛋 白激活的监测效果。在TGF-β1 诱导表达实验中，未加TGF-β1 诱导时Sp-1 未激活， LGEC-ZsGreen1DR 细胞仅在400 倍绿色荧光显微镜下可见少量弱荧光，加入TGF-β1 4h 后 275 Sp-1 激活，ZsGreen1DR 表达增加，LGEC-ZsGreen1DR 细胞绿色荧光增强，12 h 荧光蛋白 生成达到高峰，荧光最为强亮；24h 时，由于ZsGreen1DR 的半衰期已过，荧光细胞明显减 少，强度减弱。由此可见， LGEC-ZsGreen1DR 细胞能通过荧光变化敏感地监测和反映 TGF-β1 作用后Sp-1 的活性改变。 （2）LGEC-ZsGreen1DR 细胞株具有良好的稳定性：为了建立一个能够长期、反复应用 280 的抗干眼症药物高通量筛选体系，Sp-1 反应性ZsGreen1DR 报告系统必须具有良好的可传代 性与稳定性。本研究将LGEC-ZsGreen1DR 细胞株冻存1 个月后，复苏并传代培养1 个月， 重新加入TGF-β1 进行诱导表达实验，同样观察了0 h、4 h、12 h、24h 这4 个时相点，2 种 筛选体系所反映的Sp-1 活性变化亦同细胞在冻存前的情况。说明LGEC-ZsGreen1DR 细胞 株经冻存、复苏、传代后仍能有效反映TGF-β1 的诱导激活作用，提示LGEC-ZsGreen1DR 285 细胞株具有可靠的稳定性。 5 结论 成功构建了以Sp-1 顺式作用元件4×GCbox 基序为增强子、以SV40 为启动子，以 ZsGreen1-DR 为报告基因的真核表达载体p4GCbox-ZsGreen1DR。 将真核表达载体p4GCbox-ZsGreen1DR 转染LGEC 细胞，经G418 筛选后，获得了Sp-1 290 反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR，即基于Sp-1 的抗干眼症药物高通量筛选体系(1 号筛 选体系)。 经TGF-β1 诱导表达实验证实，LGEC-ZsGreen1DR 报告细胞株可通过荧光强弱变化敏 感地监测Sp-1 的活性改变，从而反映外源性物质对TGF-β1 的促进效果或拟TGF-β1 效应， 据此可进行抗干眼症药物的筛选。经冻存、复苏实验证实，LGEC-ZsGreen1DR 细胞株具有 295 可靠的稳定性。 学术论文网Tag：代写论文 论文发表 代写医学论文 医学论文发表 职称论文发表 |
