基于TGF-β1 的抗干眼症药物高通量筛选
体系的建立#
姚小磊，彭清华**
基金项目：本课题得到教育部博士学科点专项科研基金（批准号：200805410004）、湖南省自然科学基金
（批准号：07JJ3049）、湖南省科技厅科研基金（批准号：2009FJ3001）、湖南省教育厅科研基金重点项
目（批准号：10A094）和湖南省研究生创新基金（湘财教字[2008]68 号）的资助。
作者简介：姚小磊，（1982-），男，医学博士、主治医师。研究方向：眼表疾病、眼底病
通信联系人：彭清华. E-mail: pqh410007@126.com
5 （湖南中医药大学第一附属医院眼科重点学科，长沙410007）
摘要：本文建立了基于TGF-β1 的抗干眼症药物高通量筛选体系，为干眼症防治药物的研究
提供一个理想的技术平台。首先建立了含有SV40 弱启动子、4×GCbox 基序、不稳定型墨绿
色荧光蛋白ZsGreen1-DR 基因片段的报告质粒p4GCbox-ZsGreen1DR。将其转染大鼠泪腺上
皮细胞（LGEC），G418 筛选后获得了Sp-1 反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR，即基于TGF-
10 β1 的抗干眼症药物高通量筛选体系。TGF-β1 诱导表达实验结果表明，该体系加入TGF-β
1 前及加入TGF-β1 在0 h 时，LGEC-ZsGreen1DR 表达荧光的平均光密度为0.008±0.002；
在4 h 时LGEC-ZsGreen1DR 荧光的平均光密度为0.164±0.044；在12 h 达到高峰，平均光
密度为0.495±0.024；在24h 时细胞平均光密度明显下降，平均光密度为0.245±0.055。
将LGEC-ZsGreen1DR 细胞株冻存30 天，复苏并传代培养1 个月，加入TGF-β10 h 时，
15 LGEC-ZsGreen1DR 表达荧光的平均光密度为0.007±0.001；4 h 后LGEC-ZsGreen1DR 的平均
光密度为0.144±0.052；12 h 时的平均光密度为0.387±0.084；24h 时的平均光密度为0.188
±0.034；说明LGEC-ZsGreen1DR 细胞株经冻存、复苏、传代后仍能有效反映TGF-β1 对Sp-1
的诱导激活作用。
关键词：中医眼科学；TGF-β1；Sp-1；GCbox 基序；干眼症；不稳定型墨绿色荧光蛋白
20 中图分类号：R276.7
 0 引言
干眼症的致病因素很多，但一般都可以归结于其发病的共同机制——泪腺局部炎症反应
与细胞凋亡，其中TGF-β1 是泪腺局部炎症反应信号通路的关键细胞因子。现有的干眼症
的治疗方法并不理想，需要创新药物的发现，而创新药物的发现需要合适的筛选体系。传统
55 药物筛选体系的缺陷已经越来越明显：药物筛选规模小、效率低、样品需求量较大、成本高；
高通量药物筛选体系，可以解决传统药物筛选体系这一缺陷，已经渐成目前药物筛选的主要
方法，因此，本论文的研究目标是建立基于TGF-β1 的抗干眼症中药高通量筛选体系。
1 材料
1.1 菌株和质粒
60 1.1.1 宿主细菌
E.coli DH5α（大肠杆菌DH5α），购自PROMEGA 公司。
1.1.2 质粒pEGFP-N1
为增强型绿色荧光蛋白基因载体，CMVIE 为强启动子，含有Kanr/Neor 基因，由中山大
学中山眼科中心胡洁教授惠赠，购自CLONTECH 公司。
65 1.1.3 质粒pGL2-control
为基础表达型荧光素酶（Lus）报告基因质粒（Ampr），其中SV40 启动子位于42bp-244bp，
长约200bp，购自PROMEGA 公司。
1.1.4 质粒pZsGreen1-DR
含有不稳定墨绿色荧光蛋白基因（ZsGreen1-DR）的克隆载体（Ampr），其ZsGreen1-DR
70 基因位于83bp-917bp，长约830bp，购自CLONTECH 公司。
1.2 主要试剂
胰蛋白胨、酵母提取物，由Sigma 公司提供；限制性核酸内切酶AseⅠ，NEB 公司；
限制性核酸内切酶：BglⅡ、XhoⅠ、BamHⅠ、NotⅠ、HpaⅠ、EcorⅠ、HindⅢ，TaKaRa
公司；TaKaRa Ex TaqTMDNA 聚合酶、T4-DNA 连接酶、λHind Ⅲ DNA Marker、DL2000 DNA
75 Marker、PCR 纯化回收试剂盒、质粒小量抽提纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒，TaKaRa
公司提供；1640 细胞培养液、DMEM 干粉，美国Gibco 公司；胎牛血清，杭州四季清生物
工程材料有限公司；HEPES、L-谷氨酰胺，SIGMA 公司；D-Hank 干粉、PBS 干粉，美国
Hyclone 公司；人EGF、DXM、Ⅱ型胶原酶、低分子量多聚赖氨酸，美国Sigma 公司；胰
蛋白酶，美国Gibco 公司；EDTA、二甲基亚砜（DMSO），苏州正兴化工厂生产；G418，
80 PAA 公司；质粒大量抽提纯化试剂盒，索莱宝公司；LipofectaminTM2000 转染试剂盒，
INVITROGEN 公司；人转化生长因子TGF-β1，美国PEPROTECH 公司；总RNA 提取试剂
 盒、TaKaRa Ex TaqTMDNA 聚合酶，TaKaRa 公司。
1.3 实验动物
半月龄健康Wistar 大鼠20 只，雌雄不拘，远交系，SPF 级，体重150g-200g（湖南中
85 医药大学实验动物中心提供）。普通饲料喂养。用于LGEC 的原代培养。
2 方法
2.1 pSV40-EGFP 载体的构建
根据pGL2-control 质粒中SV40 启动子序列用Primer5.0 软件设计一对引物序列[1]：
P1：5’-CGGATTAATCGCGTGCTAGCTCGAG-3’ 下划线表示AseⅠ酶切位点
90 P2：5’-CCCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTA-3’ 下划线表示HindⅢ酶切位点
以pGL2-control 为模板，PCR 扩增目的片断。载体pEGFP-N1 和SV40 启动子的PCR
产物均应用AseⅠ、HindⅢ双酶切。凝胶回收所需酶切产物，用T4 DNA 连接酶进行连接。
连接产物的转化，用LB 平板(Kanr：30ug/ml)进行重组子pSV40-EGFP 的筛选。做重组子
DNA 序列测定，由Invitrogrn 中国公司测序部完成。
95 2.2 p4GCbox-EGFP 载体的构建
将人工合成的4×GCboc 基序插入到pSV40-EGFP 的XhoⅠ、BglⅡ两酶切位点之间，构
建p4GCboc-EGFP 载体[1]。做重组子DNA 序列测定，由Invitrogrn 中国公司测序部完成。
人工合成4×GCbox 基序如下
正义链：5’-TCGA(GTGGGGCGGAC)×4GA-3’
100 反义链：5’-GATCTC(GTCCGCCCCAC)×4-3’
4×GCbox 基序由大连宝生物公司合成。5’、3’侧分别有XhoⅠ和BglⅡ粘性末端，重复
4 次的GTGGGGCGGAC 为Sp-1 蛋白作用的GCbox 基序“GGGCGG”及其两端的几个保护性
的碱基。序列两端有XhoⅠ和BglⅡ粘性末端。
2.3 p4GCboc-ZsGreen1DR 载体的构建
105 将pZsGreen1-DR 质粒中的报告基因ZsGreen1DR 从EcoRⅠ和HpaⅠ酶切位点上剪切下
来，将其与p4GCbox-EGFP 载体的报告基因EGFP 替换，构建p4GCboc-ZsGreen1DR 载[1]
体。
鉴定：碱裂解法小量快速抽提质粒DNA。重组子DNA 均应用EcoRⅠ、HpaⅠ小量双
酶切鉴定。做重组子DNA 序列测定，由Invitrogrn 中国公司测序部完成。
110 2.4 大鼠泪腺上皮细胞（LEGC）的培养
在超净工作台上按常规无菌操作行大鼠泪腺摘除术，用PBS 平衡液清洗，修建，漂洗、
修剪干净的组织剪成1-2mm3 小块。使用2g.L-1Ⅱ型胶原酶消化25min，200 目尼龙筛网过滤，
离心5 min。接种培养瓶使用含EGF 的常规培养液进行培养[2，3]。
2.5 Sp-1 反应性ZsGreen1DR 报告细胞株的建立
115 2.5.1 质粒制备
碱裂解法大量抽提p4GCbox-ZsGreen1DR 载体。
 2.5.2 转染
转染前24h 以0.25%胰酶+0.02%EDTA消化法，行LGEC 细胞传代，并以细胞密度4×105/
（2ml 无抗生素DMEM＋15%NCS），接种6 孔板。第2 天待细胞融合度>90%时行转染。
使用脂质体法将目标质粒p4GCbox-120 ZsGreen1DR 转染至LEGC 细胞。转染结束后，更换培
养液，继续在6 孔板中培养24h，然后用含G418 的DMEM 完全培养液进行抗性筛选，筛
选结束后，在倒置显微镜下挑选生长良好的克隆并做好标记，克隆环法分离并消化，将筛选
出的细胞转入24 孔板中，用含G418 的DMEM 完全培养液继续扩大培养。该培养的克隆细
胞即为LGEC-ZsGreen1DR 细胞株。
125 2.5.3 报告细胞株的鉴定——PCR 鉴定
提取上述细胞的DNA，以上述细胞株基因组DNA 为模板，以前述第一节中用来扩增
SV40 启动子的下游引物和4×GCbox 寡脱氧核苷酸链的正义链为一对引物，进行PCR 鉴定。
2.6 抗干眼症药物高通量筛选体系对Sp-1 活性变化的监测效果评价——
TGF-β1 诱导表达实验
130 2.6.1 滴加TGF-β1
取上文所述的扩大培养LGEC-ZsGreen1DR 接种于6 孔板中培养，LGEC-ZsGreen1DR
细胞，待其生长达70％生长融合时，在2-6 号孔中加入TGF-β1(12.5 ng/ml)[4,5]，每孔培养液
2ml，即加入TGF-β1 储存液25ul，如下所示。
空白
培养基
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
2.6.2 观察
135 取滴加TGF-β1 之后的0、4、12、24h 一共4 个时相点，于荧光显微镜下观察细胞荧光，
随机选取4 个视野，并予以荧光图像摄像。荧光照片采用MIAS-1000 型高清晰度彩色病理
图文分析系统中的荧光表达测量系统，以2.105μm 为像素点长，在1.271×106μm2 窗口面积
下测量ZsGreen1-DR 激发荧光的平均光密度值，行半定量分析。由此方法可知每个时相点
有5 孔×4 个随机视野/孔×1 个平均光密度值/随机视野=20 个平均光密度值。
140 2.7 LGEC-ZsGreen1DR 细胞株稳定性的鉴定
2.7.1 冻存
取上文所述的扩大培养LGEC-ZsGreen1DR，以0.25%胰酶+0.02%EDTA 消化2min，
DMEM 终止反应，将细胞吹打下来后以10%DMSO+90%胎牛血清保存，按照4℃放置
30min→-20℃放置120min→-70℃放置过夜→放入液氮罐的顺序予以冻存。
 145 2.7.2 复苏
将LGEC-ZsGreen1DR 细胞株经冻存30 天后复苏，将冻存管从液氮罐中取出后，立即
投入42℃水中，待冻存管中液体全部融化后，将冻存管中液体转移至培养板中，继续以无
抗生素DMEM+15%胎牛血清培养1 个月。
2.7.3 加药观察
150 待其生长达70％生长融合时，在2-6 号孔中加入TGF-β1(12.5 ng/ml)[4,5]，每孔培养液
2ml，即加入TGF-β1 储存液25ul，如下所示。
空白
培养基
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
滴加
TGF-β1
取滴加TGF-β1 之后的0、4、12、24h 一共4 个时相点，于荧光显微镜下观察细胞荧光，
随机选取4 个视野，并予以荧光图像摄像。荧光照片采用MIAS-1000 型高清晰度彩色病理
图文分析系统中的荧光表达测量系统，以2.105μm 为像素点长，在1.271×106μm2 窗口面积
155 下测量ZsGreen1-DR 激发荧光的平均光密度值，行半定量分析。由此方法可知每个时相点
有5 孔×4 个随机视野/孔×1 个平均光密度值/随机视野=20 个平均光密度值。
2.8 统计学处理
实验所得数据均以均数±标准差(x±s)表示，各组间平均光密度比较采用方差分析，两孔
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