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之间的平均光密度比较采用方差分析中的两两比较，P<0.05 认为有显著性差异，各项统计 160 均用SPSS 13.0 统计软件在计算机上完成。 3 结果 3.1 LGEC 的细胞培养 在倒置显微镜下可见Ⅱ型胶原酶消化分散的LGEC，单个或数个细胞呈圆形，胞膜清晰、 晶莹透亮（图1）。10d 培养细胞基本融合（图2）。第2 代细胞接种后于48h 后首次全量 165 换液，见细胞基本贴壁，全部伸展生长，7d 后可单层融合（图3）。用含G418(800ug/ml) 的DMEM 完全培养液继续培养2 周之后，LGEC 细胞大量被G418 杀死，仅留下少量细胞 存活，生长缓慢，为不规则多边形或卵圆形，存活的细胞形态同未转染的LGEC（图4）。 挑选生长良好的克隆并扩大培养之后，LGEC-ZsGreen1DR 细胞逐渐生长，形态同未转染的 LGEC，细胞如铺路石状，多边形或椭圆形（图5）。LGEC-ZsGreen1DR 细胞在扩大培养之 170 后，以荧光显微镜观察，100 倍、200 倍荧光显微镜下观察未见绿色荧光，但在400 倍显微 镜下观察可见弱荧光（图6）。 图1 Ⅱ型胶原酶消化分散的LGEC（×100） 图2 培养10d 的原代LGEC（×100） 图3 培养7d 的传代LGEC（×100） 图4 G418 干预2 周的LGEC-ZsGreen1DR 细胞（×100） 图5 扩大培养的LGEC-ZsGreen1DR 细胞（×100） 图6 扩大培养的LGEC-ZsGreen1DR 细胞的弱荧光（×400） 3.2 报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR 的PCR 鉴定结果 采用PCR 法从LGEC-ZsGreen1DR 基因组DNA 中扩增到一条约250 bp 大小的DNA 片 段，该片断与4GCbox 联合SV40 175 片断大小一致，而未转染质粒p4GCbox-ZsGreen1DR 的 LGEC 细胞不能扩增获得此片段，说明此细胞株已转染了质粒p4GCbox-ZsGreen1DR，实验 已成功获取Sp-1 反应性ZsGreen1-DR 报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR，将PCR 产物进行电 泳鉴定，结果如图7 所示。 图7 LGEC-ZsGreen1DR 180 细胞与LGEC 细胞（对照）的PCR 产物电泳鉴定结果 3.3 LGEC-ZsGreen1DR 的TGF-β1 诱导表达实验结果 加入TGF-β1 前及加入TGF-β1 在0 h 时，LGEC-ZsGreen1DR 细胞仅在400 倍荧光显微 镜下观察可见少量带弱荧光的细胞，平均光密度为0.008±0.002；加入TGF-β1 在4 h 时 185 LGEC-ZsGreen1DR 细胞在100 倍显微镜下即可见绿色荧光，可见多处发光点，平均光密度 为0.164±0.044；在12 h 达到高峰，细胞荧光强亮，且发光点多，平均光密度为0.495±0.024； 在24h 时细胞平均光密度明显下降，平均光密度为0.245±0.055。见表1，图8，图9-12。 表1 LGEC-ZsGreen1DR 在不同时相的ZsGreen1-DR 荧光平均光密度值 时相 LGEC图像中ZsGreen1-DR荧光平均光密度值 0h 0.008±0.002 4h 0.164±0.044 12h 0.495±0.024 24h 0.245±0.055 190 LGEC图像中ZsGreen1-DR荧光平均光密度值 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0h 4h 12h 24h 图8 LGEC-ZsGreen1DR 在不同时相的ZsGreen1-DR 荧光平均光密度值 1 2 3 1.DL2000 DNA Marker 2.LGEC 细胞（未转染） 阴性对照结果 3.LGEC-ZsGreen1DR 细胞PCR 产物电泳结 果 250bp 图9 LGEC-ZsGreen1DR 在0h 时相发出的荧光 图10 LGEC-ZsGreen1DR 在4h 时相发出的荧光 图11 LGEC-ZsGreen1DR 在12h 时相发出的荧光 图12 LGEC-ZsGreen1DR 在24h 时相发出的荧光 195 3.4 LGEC-ZsGreen1DR 细胞株稳定性评价 将LGEC-ZsGreen1DR 细胞株冻存30 天，复苏并传代培养30 天，加入TGF-β1 在0 h 时，LGEC-ZsGreen1DR 细胞仅在400 倍荧光显微镜下观察可见少量带弱荧光的细胞，平均 光密度为0.007±0.001；加TGF-β1 诱导4 h 后LGEC-ZsGreen1DR 细胞可见较亮绿色荧光， 平均光密度为0.144±0.052；12 h 时，细胞荧光强亮，平均光密度为0.387±0.084；24h 时细 200 胞平均光密度明显下降，平均光密度为0.188±0.034；说明LGEC-ZsGreen1DR 细胞株经冻存、 复苏、传代后仍能有效反映TGF-β1 对Sp-1 的诱导激活作用。见表2，图13，图14-17。 表2 LGEC-ZsGreen1DR 在不同时相的ZsGreen1-DR 荧光平均光密度值 时相 LGEC 图像中ZsGreen1-DR 荧光平均光密度值 0h 0.007±0.001 4h 0.144±0.052 12h 0.387±0.084 24h 0.188±0.034 LGEC图像中ZsGreen1-DR荧光平均光密度值 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0h 4h 12h 24h 图13 LGEC-ZsGreen1DR 经冻存、205 复苏、传代后在不同时相的ZsGreen1-DR 荧光平均光密度值 图14 LGEC-ZsGreen1DR 在0h 时相发出的荧光 图15 LGEC-ZsGreen1DR 在4h 时相发出的荧光 图16 LGEC-ZsGreen1DR 在12h 时相发出的荧光 图17 LGEC-ZsGreen1DR 在24h 时相发出的荧光 4 讨论 4.1 干眼症发病的共同机制：泪腺局部炎症反应 210 炎症在干眼症发病机制中的重要性在近年研究中已得到充分证明。导致干眼症的各种致 病因素，通过多种炎症因子的交互作用构成的细胞因子网络，使眼表组织炎症反应加重。干 眼症患者眼表组织中多种细胞因子，目前研究重点无疑在于转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)。TGF-β1 是一种多功能生长因子，对众多的组织器官产生生物学 效应，具有免疫抑制和抗炎症的效应，能抑制促炎细胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的生成、 215 促进组织修复。抗干眼症治疗[6]能增加泪腺组织中TGF-β1 的mRNA 的水平，及促进TGF-β1 蛋白的聚集，而且TGF-β1 的增加能降低泪腺组织中IL-1β 和TNF-α 的mRNA 的水平[7]。关 键因子TGF-β1 的存在，为药物筛选提供了一个理想的靶点。 4.2 目前药物治疗干眼症存在的一些问题 现有干眼症治疗缺少药物创新，虽然利用了干眼症的发病机制说明了某些药物治疗效果 220 良好，但药物资源还很丰富，不能说明这些药物治疗效果就是最理想的——即难以使干眼症 患者得到最优化的干眼症药物治疗，缺乏创新药物的出现。 对于干眼症这一研究对象，如果要在这巨大的天然药物库中进行药物筛选，将存在着大 量样品制备和药理等方面的重复性工作，研究周期又很长，效率十分低下，严重制约着干眼 症的研究水平——即缺乏针对干眼症发病机制的创新药物筛选的共性技术和关键技术。 225 为了解决这些问题，必须针对干眼症的发病共同机制，研究干眼症药物筛选的共性技术 与关键技术，建立适合的筛选体系[8]，对药物库进行筛选，找出切合干眼症发病共同机制的 有效药物，使广大患者得到最优化的治疗。实现这一目标的关键在于：针对干眼症的发病机 制，选取适当的药靶，建立合适的药物筛选体系。 传统的中药药物筛选体系有两种[9]：一是基于整体动物模型的传统筛选体系，二是基于 230 组织器官水平筛选模型的体外药物筛选体系。这两种筛选体系局限性主要在于：药物筛选规 模小、效率低、对样品的需求量较大、成本高，造成科研经费严重浪费。 基于细胞、分子水平药物筛选模型的高通量药物筛选体系，可以解决传统药物筛选体系 不适用于巨大的药物成分库这一缺陷，已经渐成目前药物筛选的主要方法[10,11]。 对于抗干眼症药物高通量筛选体系的建立来说，要点在于高通量筛选模型的选择与建 235 立；而抗干眼症药物高通量筛选模型的要点在于药靶的选择；药靶的选择必须基于干眼症病 因的共同机制。由上文可知，TGF-β1 为其关键分子靶标，诱导TGF-β1 表达可抑制干眼症 泪腺局部炎症反应，达到治疗干眼症的目的。本文拟定以此为切入点，建立TGF-β1 反应性 抗干眼症高通量筛选基因水平的细胞稳定模型，使之成为抗干眼症创新药物开发的前提，此 即为本课题的根本立意所在。 240 4.3 建立基于TGF-β1 药物高通量筛选体系的原理与依据 如上文所述，能够激活泪腺上皮细胞TGF-β1 表达的物质或起到拟TGF-β1 效应的物质， 均可能成为抗干眼症的药物。该物质起到拟TGF-β1 效应之后，必然激活下游的信号通路， 刺激一系列的基因表达。 Sp-1 是TGF-β1 下游众多的细胞分子通路中的一支[12]，TGF-β1 与细胞表面受体结合之 245 后，必然启动下游众多细胞分子通路，导致Sp-1 上调，Sp-1 与DNA 中Sp-1 的结合位点 （binding site）结合之后，增强启动子活性[13]，上调相关基因转录。除此以外，在TGF-β1 下游众多的细胞分子通路中选择TGF-β1/Sp-1 这一支通路，还有一个重要的原因，就是 TGF-β1 表达的增强必须依靠TGF-β1 基因转录的激活，TGF-β1 基因启动序列中含有11 个 转录因子Sp-1 结合位点的保守序列“GGGCGG”（GC 盒，GCbox）[14]，Sp-1 可以明显增加 250 TGF-β1 启动子的活性，上调TGF-β1 蛋白的表达，TGF-β1 蛋白又能上调Sp-1，而形成正反 馈循环，GCbox 和Sp-1 分别是TGF-β1 基因最关键的增强子和转录因子[15]。 基因转录的激活有赖于启动子和增强子、转录因子的共同作用。本研究拟定将一个弱启 动子和Sp-1 转录因子的结合位点GCbox 基序插入ZsGreen1DR 报告基因中构建真核表达载 体，再转染泪腺上皮细胞，构建基于TGF-β1 的ZsGreen1-DR 报告系统。一旦某物质能够刺 255 激TGF-β1 表达，势必通过转录因子Sp-1 识别GCbox 基序来诱导其他基因转录，起到抗炎 的效果，我们通过仪器测试报告基因表达增强的程度，就能够判断该物质能否刺激泪腺上皮 细胞表达TGF-β1。这就是建立基于TGF-β1 的抗干眼症药物高通量筛选体系的原理与依据。 4.4 所建立的药物筛选体系评价 4.4.1 技术关键分析 260 （1）启动子的选择：由于我们的实验要通过观测报告基因的表达以反映增强子的作用 状态，从而衡量Sp-1 的活性，因此我们希望当增强子未激活前报告基因不表达或少量表达， 所以报告载体内的启动子应该为弱启动子。猿猴病毒40(SV40)是乳多空病毒群的一员，在 DNA 不复制的情况下，SV40 启动子可在广泛的哺乳动物细胞中保持较低的活性，使SV40 启动子后的基因获得较低水平的表达[16]。 265 （2）报告基因的选择：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因是目前广泛应用于蛋白表达检 测的报告基因，但EGFP 半衰期长、稳定性强，对反映一过性转录表达调控的变化不甚理想 [17]。新近研制的ZsGreen1-DR 基因的半衰期降至12h，减少了EGFP 蛋白的胞内蓄积，从而 使细胞荧光出现一个由强到弱的动态过程，能灵敏而动态地反映目的基因的转录表达。 4.4.2 本研究所建立的筛选体系能够有效监测Sp-1 的活性变化 学术论文网Tag：代写论文 论文发表 代写医学论文 医学论文发表 职称论文发表 |
