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蛋白（2.5 mg/L）后0-7 天内没有检查到PR1a 基因的表达。而当PopW 蛋白浓度达到25 mg/L 时PR1a 可持续表达3 天（图4）。喷施PopW 蛋白（2.5 mg/L）1、8、16、24 天后接种TMV， 305 在接种部位PR1a 基因表达量高于清水对照组。还发现喷施PopW 蛋白1 天后，在没有接种 TMV 处的叶片中PR1a 基因在5 天后表达量比对照组的表达量高，对照组只存在微量的表 达（图5）。 表4 PopW 蛋白诱导烟草抗TMV 的抗病性表达时间 310 Table 4 Expressive time and duration of resistance induced by PopW in tobacco against TMV (Tobacco mosaic virus) The average numbers of visible viral Duration（2.5 mg/L ） lesions on leaves PopW protein MOCK biocontrol efficacy（%） Inoculate TMV 1d after protein treatment 111.39±12.21b 159.56±13.84a 30.21 Inoculate TMV 8d after protein treatment 11.66±2.59b 21.99±4.49a 46.79 Inoculate TMV 16d after protein treatment 62.13±16.44a 85.59±17.73a 27.41 Inoculate TMV 24d after protein treatment 35.15±8.33a 37.63±10.25a 6.59 注：每个处理3 个重复，平均数后面相同的字母代表结果的没有差异性(p >0.05; LSD 检验)。 Note: Each treatment was replicated three times. Mean values followed by the same letter within a column were not significantly different (p >0.05; LSD test). 图3 PopW 蛋白不同时间段处理烟草后TMV 在叶片上引起的病斑示意图 Fig3 Duration of PopW treatment on induced resistance in tobacco against TMV 320 图4 烟草喷施PopW 蛋白后PR-1a 基因的RT-PCR 分析 Fig.6 RT-PCR analysis the expression of PR-1a in tobacco sprayed with PopW protein. 325 图5 烟草接种TMV 后不同部位叶片PR-1a 基因的RT-PCR 分析 Fig.5 RT-PCR analysis of PR-1a in tobacco inoculated with TMV. 2.4 PopW 蛋白大田防治试验 2.4.1 蛋白诱导番茄对番茄叶霉病的抗病性 330 在江苏省徐州市睢宁县庆安镇经行的番茄叶霉病生物防治大田试验结果如表5 所示，抗 菌蛋白PopW 在田间试验中显示了80%以上的防效。 335 表5 PopW 蛋白对番茄叶霉病的田间防效 Table 5 Biocontrol efficiency of PopW protein in controlling tomato leaf mold in field Treament（2.5 mg/L） Disease index Biocontrol efficacy（%） PopW 2.31±0.99c 80.19 Carbendazim 8.14±1.81b 30.21 MOCK 11.67±1.38a —— 注：每个处理4 个重复，平均数后面相同的字母代表结果的没有差异性(p >0.05; LSD 检验)。 Note: Each treatment was replicated four times. Mean values followed by the same letter within a column were not significantly different (p >0.05; LSD test). 340 图7 PopW 蛋白对番茄叶霉病的田间防效 Fig7 Biocontrol efficiency of PopW in controlling tomato leaf mold in field 345 2.4.2 PopW 蛋白诱导水稻对水稻稻曲病的抗病性 在江苏省淮安市柴米河基地进行的水稻稻曲病的生物防治大田试验结果如表6 所示，抗 菌蛋白PopW 在田间试验中显示了80%以上的防效。PopW 蛋白处理组中的水稻稻曲病的病 情指数为0.5133，三环唑处理组中水稻稻曲病的病情指数为3.4233。PopW 蛋白的防病效果 达86.84%。 350 表6 PopW 蛋白对水稻稻曲病的田间防效 Table6 Biocontrol efficiency of PopW protein in controlling Rice False Smut in field Treament（2.5 mg/L） Disease index Biocontrol efficacy（%） POPW 0.51±0.21b 86.84 Tricyclazole 3.42±0.74a 12.28 MOCK 3.91±1.39a —— 注：每个处理3 个重复，平均数后面相同的字母代表结果的没有差异性(p >0.05; LSD 检验)。 Note: Each treatment was replicated three times. Mean values followed by the same letter within a column were 355 not significantly different (p >0.05; LSD test). 2.5 PopW 蛋白大田促生试验 PopW 蛋白对辣椒有较好的的促生效果，其产量高于对照，PopW 蛋白处理组的产量为 999.8 kg/亩，较对照产量增量为16.89%。 360 表7 PopW 蛋白对辣椒的田间促生效果 Table7 Effects of PopW in promoting growth of pepper in field experiment Treament Yield of total plot (kg/亩) Yield increase (%) PopW 999.80±35.59 a 16.89 MOCK 855.30±132.85 a — 注：每个处理3 个重复，平均数后面相同的字母代表结果的没有差异性(p >0.05; LSD 检验)。 Note: Each treatment was replicated three times. Mean values followed by the same letter within a column were 365 not significantly different (p >0.05; LSD test). 3 讨论 3.1 IPTG 浓度对蛋白质生产的影响 大肠杆菌（Escherichia coli）已经被证实能对许多外源蛋白成功表达，在原核细胞中通 370 常使用IPTG 诱导产生重组蛋白。然而，它不足之处是费用大同时对人有毒。据报道，在大 肠杆菌中诱导重组蛋白乳糖与IPTG 一样有效 [39]。有大量研究表明使用强启动子可以增加 重组蛋白的表达，但是关于IPTG 浓度和蛋白表达量间关系的研究很少，在本次试验研究中 发现当IPTG 的浓度增加到0.03 mM 时，目的蛋白的表达量增加。据报道，目的蛋白的表达 量是随着IPTG 浓度的增加而增加的[40]。这也与Olaofea 等的研究一致，它研究发现在原核 375 表达的早期阶段，IPTG 浓度增加到40μM 时蛋白的表达量增加[41]。 以前有报道显示IPTG 在重组蛋白的表达是浓度范围在0.005-5mM 之间[42]。高浓度的 的诱导剂(>0.1mM IPTG)可以增加目的基因的表达量，但是会减少菌体的数量，这是由于菌 体在自身繁殖和蛋白表达之间存在着动态平衡[43,44,45]。Zheng 曾报道重组蛋白的含量随着诱 导剂的含量的增加而增加，但是蛋白的活性和稳定性随之降低[40]。诱导温度对于重组蛋白 380 的表达也有一定的影响[46]。诱导温度较低时重组蛋白的表达量增加，相反，温度较高时它 的表达量减少。然而，太低的诱导温度也将减少目的蛋白的表达。这是因为温度太低影响细 菌的生长，导致重组蛋白表达量减少。总之，诱导温度是影响外源基因在大肠杆菌中表达形 态的一个重要因素[47]。有研究表明，蛋白的表达量可以被50mg/L IPTG 和0.2%的乳糖诱导， 在20℃时比在37℃时表达量高 [48] 。 385 3.2 PopW 蛋白诱导产生抗病性 PopW 蛋白是从青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ3721 中鉴定分离得到的一个 新Harpin 蛋白，它可以诱导植物产生多种抗性[23]。随着食品和环境安全问题，在作物中的 农药和农艺化学品的使用引起人们的关注，这同时也刺激了人们对天然产物、细菌、真菌等 的安全保护和生产的研究[49,50,51]。 Harpin 蛋白可以提高环境安全性[52]、作物的产量和抗胁 390 迫能力[53] 。本实验主要研究PopW 蛋白诱导农作物和烟草产生抗性，同时2.5 mg/L 的PopW 蛋白对番茄叶霉病Cladosporium fulvum）和水稻对稻曲病（病原物是：Ustilaginoidea virens） 具有一定的防治效果，此外它对辣椒还有一定的促生效果。这个结果与[54]Chen 的研究结论 一致。在水稻中，HpaG10- 42 不仅能促进植物生长，而且诱导作物最佳的抗病性。Wu Xiaojing 曾报道说，HpaGXooc 应用可以提高产量，改善绿茶的生化特性[55]。50 mg/L 的 Harpin 可以 395 减少甜瓜红粉病（病原物是：Trichothe cium roseum）的病斑直径，同时喷施Harpin 的的甜 瓜其抑制效果延长5-7 天[56]。除农作物外，Harpin 还可以诱导烟草对TMV 的抗病性[57]。使 用Harpin 蛋白防治植物病害被认为是一种理想的方式。 3.3 PopW蛋白通过引发效应（priming）诱导植物抵抗病原菌的侵染 系统获得抗性(SAR)是诱导的植物防卫状态，是指植物在病原菌初次侵染后，植物对后 400 续病原物的侵染的抗病性增强，而且SAR 不仅在初侵染部位产生，在未处理的植物组织也 可以产生[58]。SAR 的产生伴随着致病相关基因PR 基因的激活表达[59]，PR 基因的表达是激 活植物防卫的分子标志[60]。PR 蛋白是植物防卫反应的主要物质，它可被许多胁迫诱导物诱 导表达，并且在植物防卫反应中起重要作用[26,61]。在植物遭受病原物侵染后，PR-1 蛋白的 含量是所有PR 蛋白中含量最高的，被侵染7 天后烟草中约1%的可溶性蛋白为PR1a [24] 。 405 Priming 是动、植物体内一种普遍存在的防卫反应。当被病原物、昆虫及非生物胁迫刺激时， 激活植物更快更强的细胞防卫反应，这一过程被称为priming[62,63]。它与SAR 紧密相关，是 SAR 激活的植物防卫反应中一个重要过程[64]。与没有引发priming 状态的植物不同，除非接 种病原菌，否则处于primed 状态的植物中防卫相关基因并不会大量的表达[65]。而如果primed 状态的植物接种了病原菌后，在未接种的组织中会有防卫相关基因和一些抗菌物质增强或提 410 早表达[66]。在primed 状态的植物除非接种病原菌，否则其防卫相关基因不会大量表达[67,68]。 有研究表明，在没有接种M.grisea 的情况下，用Bion 预处理的大麦中PR1b 基因的表达量 最低，显著低于接种病原菌的大麦[69]。已有研究表明priming state 可以被根围促生菌（PGPR） [62]或低浓度的SAR 诱导物、一些天然或合成物、BTH、SA 和Harpin 等诱导表达[70]。核黄 素诱导的引发效应在拟南芥对病原细菌的抗病性中发挥作用，核黄素处理后的拟南芥接种 415 DC3000 引发防卫反应基因，如PR-1,PR-2 和PAL1 均上调表达，诱导拟南芥的系统抗性[71]。 研究表明SAR 诱导物在信号通路中的双重作用，要么高剂量的SAR 诱导物直接激活PR 基 因表达，要么低剂量的SAR 诱导物不能直接激活防卫相关基因的表达，但在病原菌侵染时， 能够引发组织中防卫相关基因的增强表达[64]。Priming 使植物处于一种警备状态，可以使植 物对后续的病原菌侵染表现广谱和快速的抗性[67]。本实验室在以前的研究中已经指出PopW 420 蛋白是一个SAR 诱导剂，本研究发现低浓度的PopW 蛋白（2.5 mg/L）处理烟草后并没有 检测到PR-1a 基因的表达，而高浓度的蛋白（25 mg/L）处理后PR-1a 基因的表达量显著增 加，并且可持续到处理后3 天。此外，用PopW 蛋白（2.5 mg/L）处理烟草1d、8d、16d、 24d 后接种TMV 发现无论在接种部位还是接种部位上部的烟草叶片，其中PR-1a 基因的表 达量显著高于对照。本文得出的结论与[72] Herms 的研究结果相似，F 500 预处理的烟草在接 425 种TMV 后，与对照相比其体内PR-1a 基因出现快速、大量的表达。priming 诱导物可以增 强植物对生物和非生物的胁迫的耐受性，从而改善植物生长和提高作物产量[73]。在本实验 中我们还发现PopW 蛋白对辣椒有较好的的促生效果，比对照产量增加16.89%。 当病原物 侵染植物时，PopW 诱导烟草增强防卫反应，然而PopW 蛋白的引发效应的作用机制有待进 学术论文网Tag：代写代发论文 代写医学论文 医学论文发表 职称论文发表 |
