青枯劳尔氏菌ZJ3721 PopW 蛋白诱导
抗病性研究#
曹静1,2,3，王婷婷1,2,3，郑丽1,2,3，王翠1,2,3，刘红霞1,2,3，郭坚华1,2,3**
基金项目：国家自然科学基金（30800714）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（200803071032）
作者简介：曹静，（1987- ），女，硕士，植物病害的生物防治
通信联系人：郭坚华，（1966-），女，教授，植物土传病害生物防治，植物病原细菌学. E-mail: jhguo@njau.edu.cn
5 （1. 南京农业大学植物保护学院植物病理学系，南京 210095；
2. 江苏省生物源农药研发工程中心，南京 210095；
3. 农业部作物病虫害检测与防治重点实验室，南京 210095）
摘要：PopW 蛋白是从青枯劳尔氏菌ZJ3721 中鉴定得到。为了降低成本，我们对诱导剂-IPTG
浓度进行了筛选。IPTG 浓度筛选范围从0.0002mM 到1mM，通过SDS-PAGE 电泳利用quanlity
10 one 软件与标样（BSA）经过比对得到PopW 蛋白浓度，研究发现在IPTG 浓度为0.03 mM，PopW
蛋白含量最高。但是鉴于控制成本，我们在后续的实验中采用0.01mM 作为IPTG 的诱导浓度。
本实验室以前的研究表明其可以诱导植物产生系统抗病性，并且这种抗性属于水杨酸介导的
SAR。本文的主要研究了PopW 蛋白诱导烟草抗TMV 防卫反应中的最适宜浓度和持效性。实验
结果表明用PopW 处理的烟草叶片在接种TMV 后，其叶片上枯斑数要显著的少于对照。浓度
15 为2.5 mg/L、25 mg/L、250 mg/L 的PopW 蛋白处理烟草后，其抗TMV 的防效分别为36.24%、
64.53% 和85.39%，且其持效性可达8 天。同时我们还检测到用PopW 预处理的烟草接种TMV
后，其叶片中PR1a 基因的表达量显著的高于对照。研究还发现浓度为2.5 mg/L 的PopW 可
以分别诱导番茄、水稻对叶霉病、稻曲病的抗病性，其防效分别可达80.19%和86.84%。PopW
蛋白具有其他harpin 像似的特性，它对植物促生作用，它对辣椒产量的促生效果可达
20 16.89%。
关键词：PopW 蛋白；诱导抗病性；IPTG 最适浓度
中图分类号：S432.1
 0 引言
55 植物通过激活自身的防卫反应来抵抗病原菌的侵染，但许多病原体仍然可以逃避或抑制
宿主防御机制。当植物遭受病原物的侵染时，植物会激活特异性的防卫反应来有效的抵抗病
原物的侵染[1,2]。例如，植物可以激活一些防卫相关基因的表达来抵抗病原菌的侵染[3]。
Harpin 蛋白是富含甘氨酸，蛋白酶敏感，热稳定，由革兰氏阴性植物病原细菌产生的酸
性蛋白质 [4]。在许多植物上使用Harpins，可引起植物产生多种有益反应，包括诱导植物抗
60 病、抗虫和促进植物生长等[5,6]，这种有益反应首次在梨火疫病上发现[7]。在其他植物上使用
Harpins 也能看到相似的效果， 例如来自丁香假单胞菌丁香致病变种的HrpZPss 和梨火疫病
HrpW. 这些结果表明但还没有得到证实Harpins 通过激发特殊的信号通路诱导防御反应
[8,9]。
Bi Yang 等研究表明Harpin(商品名：Messenger)可以诱导哈密瓜对哈密瓜红粉病（病原
65 物是：Trichothecium roseum，粉红聚端孢菌）的抗病性，同时喷施了Harpin 蛋白的哈密瓜
的贮存期延长[10]。苹果青霉病是一种苹果的重要的贮存期病害，浓度为40–160mg/L 的Harpin
蛋白可以诱导苹果对苹果青霉病的抗病性，在入库前4-8 天喷施Harpin 蛋白后，苹果可以
在0.5℃保存120 天[11]。Harpin 浓度引起抗药性增加是被接种和治疗之间接种浓度的影响。
[12] 。 Anthony 报道 Harpin 可以有效防治严重的瓜类蔓枯病[13]。 Keinatha 证明在田间使用
70 了三次Harpin 蛋白后可以提高瓜类的产量[14]。
辣椒和番茄是两个重要的蔬菜作物。由于它们营养丰富并且物美价廉而深受人们的喜
爱，成为一种高消费蔬菜。但由于它们很容易发生一些病害，例如灰霉病等，每年都会给生
产上造成巨大的经济损失。但是杀菌剂若使用不当很容易造成污染给人的健康产生影响。生
物防治安全而且绿色无污染，正成为防治植物病害较为普遍的一种手段。Harpin 蛋白已被用
75 来作为替代杀菌剂防治植物病害。此外，它也可以增加农作物的产量，提高其抗逆性，改良
作物的农艺性状[15]。 这种诱导植物产生系统抗性已经作为大田中控制作物病害的一个新的
潜在措施进行研究[16] 。 当Harpin 蛋白作用植物时，它激发了一定控制生长机制的许多基
因的表达途径，包括水杨酸相关通路和茉莉酸诱导通路[17] 。
病毒病害每年都会导致严重损失,而且使植物对其他病原物的入侵更加敏感[18]。病毒病
80 害引起世界大部分地区作物严重减产，蔬菜、大豆及观赏植物质量下降[19]。 在中国、印度、
伊朗、尼泊尔、斯里兰卡和泰国部分地区的花生、土豆、番茄和大豆几种作物上，花生胚芽
坏死病毒 (GBNV) 被公认为造成经济损失最大的病毒， 每年亚洲GBNV 造成的损失估计
至少89 百万美元[20] 。 烟草花叶病毒(TMV) 是世界上发现的第一个病毒. 以前的研究表明
TMV 可以侵染 33 种常见的植物和至少200 种特殊植物, 包括烟草、番茄、辣椒、黄瓜以
85 及大多数观赏植物, 导致叶片斑驳和黄叶[21,22]。
在这项研究中，PopW 蛋白是从青枯劳尔氏菌ZJ3721 中鉴定得到具有380 个氨基酸的
新harpin 蛋白，酸性，富含甘氨酸和丝氨酸，缺少半胱氨酸，热稳定，对蛋白酶敏感，在非
寄主植物上诱导产生HR。PopW 能够诱导植物产生系统抗性，并且该抗性属于SAR [23] 。 通
 过检测水杨酸通路的标志基因PR-1a 的表达情况来研究PopW 蛋白的诱抗持效性[24] 。此外
90 PopW 是一个新的细胞防御蛋白。这句话从哪里来的 我们实验室以前的研究结果表明PopW
可以诱导烟草抵抗TMV. 本文的主要研究了PopW 蛋白诱导剂IPTG 的最适浓度。以及分析
了PopW 蛋白在温室使用条件下的最适宜浓度和持效性。此外，还发现PopW 蛋白具有一
定的防病、促进作用。
1 材料与方法
95 1.1 植物、病原物及PopW的制备
1.1.1 菌株与植物
pET-popW（BL21）E.Coli，为本实验室构建[25]，最适生长温度为37℃。
供试烟草品种为三生烟(Nicotiana tabacum cv. Xanthi NN)，于25℃温室内培养至7-8 叶
期使用。睢宁大田试验番茄品种为“银粉”，淮安大田试验辣椒品种为“杭椒”，水稻品种
100 为“籼稻99”。
1.1.2 病原菌及其接种方法
本次试验所用病毒TMV（tobacco mosaic virus），均采用摩擦接种的方法。
TMV 由本实验室保存，使用前在新鲜烟草叶片上活化并确定使用浓度。采用摩擦接种
法接种TMV。具体操作步骤如下：配制接种物所需的1%磷酸氢二钾（K2HPO4）和亚硫酸
105 钠（Na2SO3）的混合液，将1 g 磷酸氢二钾（K2HPO4）和0.1 g 亚硫酸钠（Na2SO3）溶于
100 ml 冷冻的蒸馏水中。取病叶组织1 g 加上述溶液1.5 ml，在灭菌后冷却的研钵中研成匀
浆。将匀浆用小块细纱布过滤到试管中，试管放在冰水中备用。将少量金刚砂（600 目）撒
在待接种的叶片上，用加样器吸取的TMV 悬浮液均匀点滴在叶面上，用手指在叶面上轻轻
摩擦接种。接种7-8 叶期的烟草，每张叶片均需接种，接种后的叶片用水轻轻冲洗，将试验
110 植株置于22-25℃温室中培养[26]。
1.1.3 PopW 抗菌蛋白制备
将含有重组质粒pET-popW 的转化子BLPopW接种于5 ml 含有50 mg/L 卡那霉素的LB
液体培养液中，37℃振荡培养过夜。按1%的比例接入含有50 mg/L 卡那霉素的新鲜LB 液
体培养液中，37℃振荡培养至OD600 为0.6-0.8，加入终浓度为1.0 mM 的异丙基-β-D-硫代半
115 乳糖苷（Isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside, IPTG），37℃继续振荡培养3 h[27]。
上述菌液5, 000×g，4℃，离心5 min，收集菌体，然后用1/100 体积的灭菌水重悬菌体，
水煮，沸腾10 min 以破壁，10, 000×g，4℃，离心10 min，收集上清液即为初步纯化的可溶
性蛋白，以浓度为1 mg/ml 的BSA 为标样，用10%的SDS-PAGE 检测[28]。制备好的PopW
蛋白稀释后，加终浓度为0.01%的表面活性剂Silwet L-77 喷雾处理实验材料，喷施时每张
120 叶片都要均匀喷到。
1.2 不同IPTG 浓度对PopW蛋白表达量的影响
为了研究IPTG 诱导PopW 蛋白的最佳诱导浓度，我们把IPTG 的浓度设以下几个梯度，
分别是：0、0.0002、0.0005、0.0008、0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.03、0.05
和1 mM。诱导表达获得的目标蛋白利用SDS-PAGE 蛋白电泳进行定量分析。利用quanlity
125 one 软件通过与BSA（小牛血清蛋白）标样比对得出蛋白的含量，以进一步研究IPTG 浓度
 对PopW 蛋白表达量的影响。
1.3 不同浓度PopW蛋白对烟草抗病性影响
烟草品种为三生烟(Nicotiana tabacum)。实验设以下几个处理，分别为：①PopW 蛋白
稀释100 倍（250 mg/L）、②PopW 蛋白稀释1000 倍（25 mg/L）、③PopW 蛋白稀释10000
倍（2.5 mg/L）、④PopW 130 蛋白稀释30000 倍（0.83 mg/L）、⑤PopW 蛋白稀释50000 倍（0.5
mg/L）、⑥清水处理为空白对照（MOCK）。每处理8 株，每处理重复3 次。PopW 蛋白稀
释后，加终浓度为0.01%的表面活性剂Silwet L-77 喷雾处理烟草叶片。PopW 蛋白处理1d
后接种TMV（接种方法见1.1.2），接种3 天后调查每张叶片上的枯斑数，计算枯斑抑制率，
即为PopW 蛋白的防治效果。防治效果=[(对照叶片上枯斑数—处理叶片枯斑数)/对照叶片上
135 枯斑数]×100%[29]。以此确定PopW 蛋白诱导烟草抗病性的最佳浓度。
1.4 PopW蛋白诱导烟草对TMV 抗病性最佳诱导时期和持效期
PopW 蛋白稀释10000 倍后（浓度为2.5 mg/L），加终浓度为0.01%的表面活性剂Silwet
L-77 喷雾处理烟草叶片，同时设立空白对照（不喷施蛋白，只接种TMV）和PopW 对照（只
喷施PopW 蛋白）。PopW 处理24 h、8 d、16 d、24 d 后接种TMV，每棵苗接种2-3 片叶。
140 自接种病原后0 h、24 h、48h、3 d、5 d、7 d 取样，提取总RNA 时，取样时分别取接种TMV
处的叶片和它上部不接种TMV 的叶片，每个处理取3 株烟叶相似叶位的叶片混合[30]。接种
3 天后进行病情调查，记录烟草叶片上的病斑数。然后计算PopW 蛋白不同时间处理后对
TMV 的防治效果：防治效果=[(对照叶片平均病斑数-处理叶片平均病斑数)/对照叶片平均病
斑数]×100 %。
145 1.5 PopW蛋白诱导植物PR1a 基因表达检测
1.5.1 植物RNA 的提取（Trizol 法）
（1）取0.1 g 的新鲜叶片，在液氮中研磨，加入到含 2 mL Trizol 提取液的离心管中，
用力摇匀，室温放置 5min。
（2）4℃ 12000×g 离心10 min，上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），用力
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