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150 摇匀，室温放置5min。 （3）4℃ 12000×g 离心10 min，上清液转移到5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇， 混匀后室温静置10 min，沉淀RNA。 （4）4℃ 12000×g 离心10 min，去除上清，然后用 DEPC 水配制的 75% 乙醇洗涤 RNA。 155 （5）4℃ 7500×g 离心5 min，将 RNA 沉淀置于超净台上干燥，用RNase-free 水溶解 RNA。 1.5.2 sscDNA 的合成 RT 反应参照大连 TaKaRa 生物公司的 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) 说明书进行。反 应体系如下： 160 10×RT Buffer 1 μL MgCL2 (25mM) 2 μL dNTPs (10 mM each) 1 μL RNase Inhibitor 0.25 μL AMV Reverse Transcriptase XL (5U/μL) 0.5 μL Oligo dT-Adaptor 165 Primer (2.5pmol/μL) 0.5 μL 实验样品RNA 1 μL RNase Free H2O 3.75 μL Total 10μL 反应程序为：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。 170 1.5.3 引物的设计 PopW 能够诱导植物产生系统抗性，并且该抗性属于SAR。通过检测水杨酸通路的标志 基因PR-1a 的表达情况来研究PopW 蛋白的诱抗持效性[31,32,33]。具体引物序列如表1。因为 这些基因产物的大小和退火温度相近，所以我们设计了相同的反应体系和程序来扩增这些目 的基因。PR-1a：95℃，5 min；95℃，30 sec，58℃，45 sec,72℃，40sec，30 循环；72℃， 175 10 min；EF-1α：95℃，5 min；95℃，30 sec，58℃，45 sec,72℃，40sec，30 循环；72℃， 10 min； 表 1 本研究所用的引物 Fig. 1 primers used in this study 基因 Gene 基因登陆号 Gene accession no 引物序列 primer sequence 片段长度/bp Segment length PR-1a X05959 FRoervwerasred:: 55’’--AGAGCCGGGTATCCTTCTTTCTTGTCCCATCCATAATTTAGACTCTTATCCCATTG--33’’ 495 EF1α X97131 RFoervwerasred:: 55′′CACGAACCCCAAACTCCATATGGTTAACCTAACCATTGCCCA 3C′ 3′ 495 180 PCR 反应体系如下： 10×PCR buffer 4μL MgCL2 (25mM) 3.2μL dNTPs (2.5 mM each) 3.2μL 185 上游引物 2μL 下游引物 2μL ExTaq DNA polymerase (5 U /μL) 0.8μL DNA 模板 2μL ddH2O 22.8μL 190 total 40μL PCR 扩增程序： 95℃, 5 min; 95℃, 45 sec; 58℃, 45 sec; 30 cycles; 195 72℃, 45 sec, 72℃, 10 min 1.6 PopW蛋白大田防病、促生实验 1.6.1 PopW 蛋白对番茄叶霉病的防治 2009 年，在江苏省睢宁县庆安镇（东经117º94’，北纬33º90’）选取田块533 m2 作试验 200 田，试验采用完全随机设计。每块田中包含3 个处理，每个处理4 个重复。每个重复的小区 面积为33 m2 （2.3 m×14.3 m），种有150 棵番茄（番茄品种为银粉1 号）。小区与小区之 间均设有保护行。设常规农药多菌灵（Carbendazim，使用浓度为300ppm，喷雾使用）为对 照药剂，以清水处理为空白对照（MOCK）。PopW 蛋白使用浓度为2.5mg/L，加终浓度为 0.01%的表面活性剂 Silwet L-77 喷雾处理叶片，移栽后7d 进行第1 次施药，以后每隔10 d 205 后施药一次，在番茄的整个生长期间共施药8 次。蛋白处理后88 天，调查PopW 蛋白对番 茄叶霉病的防治效果并记录，大田试验均采用标准的田间管理模式，并且不再使用任何其它 的杀菌剂。 调查方法：每个小区5 点取样，每点选2 株，每株各选5 片叶片(既定点、定株)挂牌调 查。番茄叶霉病的病害分级标准如下： 210 番茄叶霉病的分级标准[34]：以每株每一片叶上的病斑面积占整个叶面积的百分率来分 级病叶分级标准: 0 级: 无病斑； 1 级：病斑面积占整片叶面积的5%以下； 3 级：病斑面积占整片叶面积的6%～10%； 215 5 级：病斑面积占整片叶面积的11%～20%； 7 级：病斑面积占整片叶面积的21%～50%； 9 级：病斑面积占整片叶面积的50%以上； 病害严重度和防效的计算公式如下： 病害严重度= [Σ(病植株数×病情指数)/(总植株数×最高病情指数)]×100% 220 生防效果%=[(对照病害严重度－处理病害严重度)/对照病害严重度]×100% 1.6.2 PopW 蛋白对水稻稻曲病的防治 2009 年，在江苏省淮安市柴米河实验基地（东经119º05’，北纬33º30’）选取田块610 m2 作试验田，试验采用完全随机设计。每块田中包含3 个处理，每个处理有3 个重复。每个重 复的小区面积为64 m2（4 m×16 m），水稻品种为“籼稻99”。小区与小区之间均设有保护 225 行。设常规农药三环唑（tricyclazole，使用浓度为300 mg/L，喷雾使用）为对照药剂，以清 水处理为空白对照。PopW 蛋白使用浓度为2.5mg/L，加终浓度为0.01% 的表面活性剂 Silwet L-77 喷雾处理水稻，移栽后30d（2009 年8 月5 日移栽）进行第1 次施药，以后每隔 10 d 施药一次，在水稻的整个生长期间共施药5 次后调查PopW 蛋白对稻曲病的防治效果， 大田试验均采用标准的田间管理模式，并且不再使用任何其它的杀菌剂。蛋白处理后50 天， 230 调查病害严重度并记录。 调查方法：每小区5 点取样，每点选5 穴，调查每穗上曲果粒数。稻曲病病情新的分级 标准[35]： 0 级：未发病；1 级：每穗1 粒曲果；2 级：每穗2 粒曲果；3 级：每穗3～5 粒曲果；4 级：每穗6～9 粒曲果；5 级：10 粒以上曲果。 235 病害严重度和生防效果的计算方法如下： 病害严重度=[Σ(病植株数×病情指数)/(总植株数×最高病情指数数)]×100% 生防效果%=[(对照病害严重度－处理病害严重度)/对照病害严重度]×100% 1.6.3 PopW 蛋白大田促生实验 2009 年，在江苏省淮安市柴米河实验基地（东经119º05’，北纬33º30’）选取田块179m2 240 作试验田，试验采用完全随机设计。每块田中包含2 个处理，每个处理有3 个重复。每个重 复的小区面积为30 m2（4 m×7.5 m），辣椒品种为杭椒。小区与小区之间均设有保护行。设 PopW 蛋白为处理组，以清水处理为空白对照。PopW 蛋白使用浓度为2.5mg/L，加终浓度 为0.01%的表面活性剂Silwet L-77 喷雾处理辣椒，移栽后15d（2009 年8 月20 日移栽）进 行第1 次施药，以后每隔10d 施药一次，在辣椒的整个生长期间共施药8 次后统计PopW 蛋 245 白对辣椒的促生效果，大田试验均采用标准的田间管理模式，并且不再使用任何其它的杀菌 剂。 1.7 数据分析 温室试验结果中的防效以及大田试验中的病害严重度、防效、产量、增产率等数据在 Microsoft Excel 中进行基本处理后，用SAS（SAS Institute, Version 6, Cary, NC）通用线性模 250 型中的least significant difference (LSD) Tes（t P＝0.05）, One-Way ANOVA analysis 进行分析。 2 结果与分析 2.1 不同 IPTG 浓度梯度对PopW蛋白表达量的影响 pET30 是融合表达载体，诱导表达的PopW 融合蛋白分子量约为39.79 KDa（45 KDa）， 不同种浓度的IPTG 诱导PopW 蛋白表达量不同[36,37,38]，随着IPTG 浓度的增加PopW 蛋白 255 的表达量逐渐增加，当IPTG 的浓度为0.03 mM 时蛋白的表达量最大，但是与诱导剂浓度为 0.01 mM 时蛋白含量并没有显著增加，诱导剂的浓度继续增加蛋白表达量反而减少，最佳的 IPTG 浓度为0.01mM（图1，表2）。 260 图1 不同IPTG 浓度对PopW 蛋白表达量的影响 Fig1. Effect of the different IPTG concentration on expression levels of recombinant proteins PopW(A、B and C). M，低分子量的蛋白marker；BSA 是小牛血清蛋白；BSA1，小牛血清蛋白含量为2 μg；BSA2，小牛血清 蛋白含量为5 μg；BSA3，小牛血清蛋白含量为10 μg； 265 M :low molecular weight of protein marker; The number above the lane are the concentration of IPTG (Mm);BSA is stand for bovine serum albumin,BSA1is about 2 μg of bovine serum albumin, BSA2is about 5 μg of bovine serum albumin, BSA3 is about 10 μg of bovine serum albumin. 表2 不同IPTG 浓度对PopW 蛋白表达量的影响 Table2 Effect of the different IPTG concentration on expression levels 275 of fusion proteins PopW IPTG concentration (mM) Total recombinant protein (μg/μl) 0 0 0.0002 13.65±1.27g 0.0005 20.55±3.14f 0.0008 21.29±0.79f 0.001 24.72±2.38e 0.002 28.26±3.24d 0.004 30.12±1.19cd 0.006 27.91±1.58bcd 0.008 29.38±0.39bcd 0.01 31.11±0.85a 0.03 34.71±1.94a 0.05 31.42±0.52a 1 28.99±2.71bcd 注：数据为三次重复的平均值，平均数后面相同的字母代表结果的没有差异性(p >0.05; LSD 检验)。 Note: Each treatment was replicated three times. Mean values followed by the same letter within a column were not significantly different (p >0.05; LSD test). 280 2.2 PopW 蛋白诱导烟草对TMV 抗病性的最佳浓度测试 将不同浓度的PopW 蛋白喷雾处理烟草,1d 后接种TMV ,结果见表3,图2。浓度为2.5 mg/L、25 mg/L、250 mg/L 的PopW 蛋白的病害严重度与对照有显著差异 ,并且随浓度增加， 病害严重度明显降低。其中2.5mg/L、25mg/L、250 mg/L 的PopW 蛋白效果较好,诱导烟草 抗TMV 的效果分别达到36.24 %、64.53%、85.39%。 285 表3 不同浓度PopW 蛋白诱导烟草抗TMV 的作用 Table 3 Effects of PopW with various concentrations on resistance induction in tobacco against TMV(Tobacco mosaic virus) Treament（mg/L） MOCK PopW protein 0.5 0.83 2.5 25 250 The average numbers of visible viral lesions 161.33±2 7.73a 149.97±3 4.28a 151.59±3 9.75a 102.86±3 6.99b 57.22± 42.61c 23.57± 17.21d biocontrol efficacy（%） —— 7.05 6.04 36.24 64.53 85.39 注：每个处理3 个重复，平均数后面相同的字母代表结果的没有差异性(p >0.05; LSD 检验)。 290 Note: Each treatment was replicated three times. Mean values followed by the same letter within a column were not significantly different (p >0.05; LSD test). 图2 不同浓度PopW 蛋白处理后TMV 在叶片上引起的病斑示意图 Fig2.The lesion on different 295 leaves infected by TMV 2.3 PopW 蛋白诱导烟草对TMV 抗病性最佳诱导时期和持效期 PopW 蛋白（浓度为2.5 mg/L）处理1 天后摩擦接种TMV，烟草的诱导抗病效果达 30.21%；处理8 天后接种TMV 诱抗效果达46.79%。处理16 天、24 天后接种TMV，PopW 300 蛋白的诱抗效果分别为27.41%和6.59%，效果较1 天和8 天显著下降。以上实验说明浓度 为2.5 mg/L 的PopW 蛋白的诱抗效果可达8 天（表4，图3）。 同时我们还从mRNA水平检测喷施蛋白接种TMV后PR1a 基因的表达情况。喷施PopW 学术论文网Tag：代写代发论文 代写医学论文 医学论文发表 职称论文发表 |
