【摘要】 胃癌是一种涉及编码基因与非编码基因在结构和表达上发生异常的复杂的恶性疾病。世界每年胃癌新发病例近百万，严重威胁到人类健康。胃癌的早期诊断与治疗对患者的病情及预后至关重要，实现胃癌的早期诊断可以大大提高患者长期生存率及生活质量。目前常用的癌症诊断方法有病理学诊断、物理学诊断(影像学诊断)和血清学检查癌症相关标志物等癌症中晚期诊断方法。这些方法或操作复杂，费用昂贵；或需要施行手术，给机体造成损伤，最重要的是往往给无症状胃癌人群造成诊断延误。基因诊断是当前癌症早期诊断研究领域的热点，胃癌的基因诊断研究主要体现在有相关癌基因的检测、胃癌特异癌基因的检测和胃癌相关病因检测等方面。miRNA的发现为癌症早期诊断的研究提供了崭新的研究领域。miRNA是一类长约19-24个核苷酸的保守的非编码小分子RNA，主要通过与靶mRNA的3’非翻译区相结合，在转录后水平降解和沉默mRNA。目前人们已通过多项癌症研究证明：癌症miRNAs在肿瘤发生和发展过程中所起到的角色与原癌基因或抑癌基因发挥的作用是相似的。胃癌是世界上死亡率排第二位的恶性肿瘤。为了能早期诊断和治疗胃癌，有必要以胃癌miRNAs为研究对象去寻找具备高灵敏度和特异性的早期诊断和治疗的基因标志物。本研究首先采用AFFX miRNA表达谱芯片来分析胃癌患者中异常表达的miRNA，并用定量PCR的方法对芯片结果进行验证。其次，通过生物信息学方法筛选miR-574-3p在胃癌中可能的靶基因，并通过在体外SGC7901胃癌细胞系中转染miR-574-3p mimics进行间接验证；最后，我们还研究了miR-574-3p mimics转染SGC7901细胞系之后的细胞增殖、迁移和侵袭能力等生物学功能改变。1.胃癌组织中miRNAs的差异表达为了获得在胃癌和正常组织中差异表达的miRNAs信息，本研究采用AFFXmiRNA表达谱芯片对13对胃癌组织及与其相对应的癌旁正常组织进行比较分析，来研究其中差异表达的miRNAs。芯片结果共发现16个miRNAs异常表达，相对于癌旁组织而言，胃癌组织中14个表达下调，2个表达上调。在这些miRNAs中，miR-455-3p表达上调，miR-574-3p、miR-1207-5p、miR-486-5p及miR-768-5p表达下调，而且均没有它们在胃癌中的相关报道。为了验证芯片结果的准确性，本研究选择miR-31、miR-574-3p、miR-768-5p和miR-455-3p通过荧光定量PCR方法检测其20例胃癌组织和20例正常组织中的表达情况。定量PCR结果显示miR-31、miR-574-3p和miR-768-5p在胃癌组织中的表达水平要显著低于与相对应的正常组织的表达量（P<0.01），而miR-455-3p在胃癌组织中的表达水平要高于与相对应的正常组织的表达量（P<0.01），与芯片检测结果相一致。意外的发现miR-574-3p的表达水平在高分化的胃癌组织中的表达量要低于中低分化的胃癌组织的表达量（P<0.05）。这种低表达量也出现在早期的胃癌组织中（I-II期的胃癌组织的表达量要低于III-IV期胃癌组织的表达量）（P<0.05）。此外，miR-574-3p的表达水平与胃癌是否转移、及患者性别和年龄无关。这说明了miR-574-3p可能在胃癌的分级分化中发挥一定的作用。以往研究中未见关于miR-574-3p在肿瘤组织中差异表达的报道，为了获得关于它的进一步信息，我们在后续实验中就miR-574-3p的靶mRNA及相关的生物学功能进行了研究。2. miR-574-3p潜在靶基因的预测及初步验证miRNAs是通过与它们的靶mRNAs相互作用后导致mRNA的降解或转录后抑制来调节基因表达。为了找出miR-574-3p可能的靶基因，本研究利用TargetScan和miRBD这两种靶基因预测软件进行靶基因的预测分析。在共预测出的31个可能的靶基因中，RXRA和CUL2显示出较高的可能性，因为它们在这两种不同的预测算法均被预测出来。而且，课题组前期80对胃癌及癌旁组织基因表达谱芯片结果显示，在上调的807个mRNAs中，只有RXRA和CUL2被预测出来，因此，我们推测RXRA和CUL2可能是miR-574-3p的靶基因。接下来，又通过定量PCR的方法验证了软件预测以及表达谱芯片的结果。结果显示RXRA和CUL2mRNA在胃癌组织中确实是高表达的。为了提供更有力的证据来验证RXRA和CUL2基因是否是miR-574-3p的靶基因。本研究将miR-574-3p mimics转染进SGC7901胃癌细胞系中，然后通过定量PCR的方法检测RXRA和CUL2分别在24h和48h的mRNA表达水平。结果显示miR-574-3pmimics转染组CUL2mRNA表达水平显著低于Mock组。但RXRA mRNA表达水平无明显变化。结果提示仅CUL2基因可能是miR-574-3p的靶基因。3.转染miR-574-3p后对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响为了研究miR-574-3p在胃癌中的生物学功能，本研究将miR-574-3p mimics转染到胃癌细胞系SGC7901中进行获得性功能研究。CCK8实验结果表明，转染miR-574-3pmimics后的SGC7901细胞数减少到Mock组的74.5%。我们进一步分析miR-574-3p对胃癌细胞迁移和侵袭生物学行为的影响。迁移实验结果显示转染了miR-574-3p mimics的SGC7901细胞的迁移能力与Mock相比减少了37.9%。而且，侵袭实验也显示miR-574-3p mimics能降低SGC7901细胞的侵袭能力达63.7%。上述结果提示miR-574-3p的表达水平与胃癌细胞的迁移和侵袭能力密切相关。综上所述，miRNA表达谱芯片和定量PCR均证实miR-574-3p在胃癌组织中表达显著下降。CUL2可能是miR-574-3p在胃癌细胞中的靶基因。体外研究证实miR-574-3p过表达可显著抑制胃癌细胞SGC7901的增殖、迁移和侵袭，提示miR-574-3p在人胃癌中是一个潜在的肿瘤抑制miRNA。 

 

【关键词】 胃癌； miR-574-3p； 肿瘤分级分期； 靶基因； 生物学功能；