【摘要】 1背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是多因素参与的复杂病理过程,近年来研究表明免疫反应,包括天然免疫和获得性的免疫机制在AS形成和发展过程发挥了重要作用。但是其具体的作用机制并未得到完全的阐述。易损斑块是指易于形成血栓或可能迅速进展为罪犯病变的斑块,特点为具有较薄的纤维帽、较大的脂核(占斑块体积的40%以上)、平滑肌细胞密度低、胶原含量少、活化巨噬细胞和T淋巴细胞浸润增加,细胞因子合成和释放增加,部分斑块内部伴有明显的新生血管生成或斑块内出血的特点。调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)作为特殊类型的CD4+T细胞亚群,是免疫系统的重要组成部分。Tregs参与机体自身的免疫耐受调节,终止活化的免疫反应,在调节免疫系统平衡、维持机体内环境的稳定以及控制自身免疫性疾病的进展中发挥了重要作用。Tregs数量的缺失或功能的失活将会破坏机体免疫内环境的稳定,导致自身免疫和炎症反应的无限放大。Tregs在AS过程中的作用已经受到越来越多的关注。新的证据表明在ApoE-/-小鼠中给予Tregs治疗可阻止早期AS的形成,但其具体的机制尚未阐明。对于大多数急性心血管事件来说,易损斑块的稳定性是决定因素。到目前为止,Tregs是否影响易损斑块的稳定性尚未报道。2目的(1)体内试验中,观察Tregs对易损斑块破裂率的影响和斑块内成分的改变。(2)体外试验中,探讨Tregs稳定易损斑块的分子机制。3方法3.1Tregs的分选分离8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾细胞,利用磁珠分选技术获得纯化的Tregs。纯化的Tregs按要求分别溶于200μl PBS中,以备下一步操作。3.2动物模型的建立8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周后,右侧颈总动脉套管诱导AS斑块形成。颈动脉套管手术8周后,将ApoE-/-、鼠随机分为5组：A:Control组(无任何干预)；B:PBS组(尾静脉注射200μl PBS); C:小剂量Tregs干预组(small-dose Tregs组,SD组,尾静脉注射105Tregs); D:中剂量Tregs干预组(moderate-dose Tregs组,MD组,尾静脉注射3×105Tregs); E:大剂量Tregs干预组(large-dose Tregs组,LD组,尾静脉注射106Tregs).两周后重复上述操作一次。Tregs第一次注射第二天,将所有ApoE-/-实验小鼠置于容积为50ml大小、带通气孔的塑料管中(确保足够的通气和声音传播),同时进行噪音刺激。噪音刺激强度为110dB,噪音每次持续3秒,间隔为5分钟。每天持续6小时,总共四周时间。实验第14周末,ApoE-/-小鼠被处以安乐死。3.3体重、血脂和血压的测量实验的0周和14周末,分别测量每组ApoE-/-小鼠的体重。14周末,测量ApoE-/-小鼠的尾动脉血压,同时收集小鼠血清,检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。3.4组织病理学的检测制备右侧颈动脉切片,对颈动脉斑块进行H&E、天狼猩红和油红O染色,观察斑块的破裂率,并应用免疫组织化学的方法检测颈动脉斑块内MOMA-2、SMCs、MCP-1、 TNF-α、IL-6、MMP-2、MMP-9和IL-17的表达,计算易损指数。3.5细胞共培养首先利用磁珠分选将Tregs和CD4+CD25-T细胞从健康人群外周血单核细胞中游离。人血管平滑肌细胞随机分为5组：Control组(未做任何处理)；CD25组(细胞培养基中加入5×105CD4+CD25-T细胞)；Tregs组(细胞培养基中分别加入1.25×105,2.5×105和5×105Tregs)。在anti-CD3antibody (50ng/ml)存在的情况下培养40小时后,加入TNF-α (100ng/ml)继续刺激8小时。在另一组试验中,anti-TGF-β或anti-IL-10在Tregs和平滑肌细胞共培养前分别加入3.6RT-PCR收集右侧颈颈动脉组织或各组平滑肌细胞,提取RNA,检测颈动脉内Foxp3、TGF-β、IL-10、MMP-2、MMP-9以及平滑肌细胞内P4Hα1、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1、 MMP-2、MMP-9mRNA的表达。3.7Western blot收集右侧颈颈动脉组织或各组平滑肌细胞,提取蛋白,检测颈动脉内Foxp3、 TGF-β、IL-10、MMP-2、MMP-9、P4Hα1以及平滑肌细胞内P4Hα1、MMP-2、MMP-9、 JNK、ASK1蛋白的表达。3.8ELISA检测收集各组细胞上清,检测细胞上清中Ⅰ、Ⅲ胶原、TGF-β和IL-10的水平浓度。4结果4.1动物一般情况5组ApoE-/-小鼠体重、血压以及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无显著统计学差异。4.2Tregs阻止斑块的破裂对照组50%(8/16例),PBS组50%(8/16例),SD组43.8%(7/16例),MD组12.5%(2/16例)和LD组12.5%(2/16例)的AS斑块发生了破裂。MD组和LD组斑块破裂率明显低于对照组、PBS组和SD组。4.3Tregs对斑块成分的影响MD组和LD组颈动脉斑块内巨噬细胞含量、脂质含量和易损指数明显低于对照组、PBS组和SD组；而平滑肌细胞和胶原的含量则明显高于对照组、PBS组和SD组。4.4Tregs降低炎症因子的表达体内试验中,MD组和LD组颈动脉斑块内MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-17的表达明显低于对照组、PBS组和SD组。体外实验中,不同剂量的Tregs组MCP-1, VCAM-1和ICAM-1mRNA的表达均明显低于对照组和CD25-组。4.5Tregs降低MMP-2和MMP-9的表达体内试验中,MD组和LD组颈动脉斑块内MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平明显低于对照组、PBS组和SD组。免疫组化和western blot的对MMP-2和MMP-9蛋白的检测也证明了相同的趋势。体外实验中,Tregs组MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和CD25-组。4.6Tregs对P4Hα1表达和ASK1-JNK通路的影响体内试验中,western blot检测发现MD组和LD组颈动脉斑块内P4Hα1蛋白表达的水平明显高于对照组、PBS组和SD组。体外试验中,Tregs组P4Hα1mRNA和蛋白的水平明显高于对照组和CD25-组。ELISA证实Tregs组细胞上清中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的水平浓度较对照组和CD25-组明显升高。Tregs和平滑肌细胞共培养后,可部分的消除TNF-α对ASK1-JNK的激活作用。从而证实了Tregs通过抑制ASK1-JNK通路而促进P4Hal的表达。4.7Tregs促进TGF-β和IL-10的表达体内试验中,MD组和LD组颈动脉斑块内TGF-β和IL-10的mRNA和蛋白的水平明显高于对照组、PBS组和SD组。体外试验中,收集各组细胞上清利用ELISA检测TGF-β和IL-10的水平,发现Tregs组TGF-β和IL-10的浓度明显高于对照组和CD25-组。4.8TGF-β或IL-10介导Tregs对P4Hα1和炎症因子的作用为进一步验证Tregs对炎症因子、MMP-2、MMP-9和P4Hα1的作用是否通过分泌TGF-β和IL-10而发挥的,我们预先将TGF-β或IL-10的中和抗体加入细胞培养基中。RT-PCR检测发现TGF-β和IL-10中和抗体部分抵消了Tregs对MCP-1、VCAM-1和ICAM-1mRNA的抑制作用。MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达在TGF-β和IL-10中和抗体加入后也明显升高。相反,加入中和抗体后,P4Hα1的mRNA和蛋白的表达则明显的降低。证明了Tregs部分是通过产生TGF-β和IL-10而介导对炎症因子、MMP-2、 MMP-9和P4Hα1的作用。5结论(1)在ApoE-/-小鼠易损斑块模型中,Tregs可剂量依赖性地稳定易损斑块,降低斑块的破裂率。(2) Tregs稳定AS易损斑块的机制为抑制或减轻机体局部炎症反应,减少炎症因子和MMP-2、MMP-9的释放,促进抗炎因子分泌,提高P4Hα1的水平和抑制ASK1-JNK的信号通路。(3) Tregs的作用部分依赖于本身分泌的TGF-β和IL-10。1背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)被认为是一种炎症性疾病,炎症在AS的发生和发展过程中发挥了关键作用。而炎症反应与免疫反应两者密切相关,许多重要的免疫因子可诱导和调控炎症反应,而包括单核巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞在内的许多炎症细胞也具有重要的免疫功能。而在包括系统性红斑狼疮、全身性硬化症和类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病中均发现了AS加速的过程。他汀类药物除具有强有力降脂作用外,还包括改善内皮功能、抗炎、抗氧化等,可阻止AS的形成和促进AS易损斑块的稳定。此外,他汀类具有免疫调节的特性,抑制IFN-y诱导的主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原的表达和效应性T细胞的活化,而且研究认为他汀类药物稳定AS的作用部分的依赖于他们的免疫调节机制。调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)是特殊的CD4+T细胞亚群,我们前文的研究发现Tregs具有抑制炎症细胞浸润和炎症因子释放,减轻炎症反应的特性。到目前为止,他汀类药物的治疗是否可以影响斑块内Tregs数量并未有相关报道。2目的(1)观察他汀类药物治疗对AS斑块内的Tregs数量的影响。(2)观察他汀类药物对ACS患者外周血中Tregs数量和功能的影响。3方法3.1动物模型的建立40只10周龄的雄性ApoE-/-小鼠给予高脂喂养2周后,予右侧颈总动脉套管以诱发AS斑块形成。套管术后继续高脂喂养,术后6周将ApoE-/-小鼠随机分为2组(每组20只)：A：辛伐他汀组(辛伐他汀溶于0.5%methylcellulose,按50mg/kg/d量灌胃)；B:Control组(同体积的0.5%methylcellulose单独灌胃)。治疗6周后处死动物。3.2血脂检测试验14周末,收集小鼠血清,检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。3.3组织病理学的检测制备颈动脉切片,免疫组织化学的方法检测颈动脉斑块内Foxp3、IL-4、IL-1β、IFN-γ和IL-17的表达。3.4RT-PCR收集右侧颈颈动脉组织,提取RNA,检测颈动脉内Foxp3、TGF-β、IL-10、IL-4. IL-1β、IFN-γ和IL-17mRNA的表达。3.5Western blot收集右侧颈动脉组织,提取蛋白,检测颈动脉内Foxp3、TGF-p和IL-10蛋白的表达。3.6ELISA检测收集小鼠血清,检测IL-10、IFN-y和IL-17的水平浓度。3.7细胞培养抽取ACS患者外周血,提取外周单核细胞后,置于含有10%FBS和1%双抗的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×106cells/ml。随机分为三组：(1) Control组；(2)低剂量辛伐他汀组(培养基中加入1μM辛伐他汀)；(3)高剂量辛伐他汀组(培养基中加入10μM辛伐他汀)。细胞培养96小时后,流式细胞仪检测3组Foxp3表达。另外,利用磁珠从ACS患者外周血中分选出Tregs和CD4+CD25-T细胞,将Tregs和CD4+CD25-T细胞按不同的比率(1：1,1：2,1：4,1：8)在anti-CD3和抗原提呈细胞存在的情况下孵育72小时后,加入1μCi[3H]-thymidine继续孵育16小时,评价Tregs的抑制功能。4结果4.1动物一般情况两组ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无显著统计学差异。4.2辛伐他汀上调Foxp3、TGF-β和IL-10的表达免疫组化结果显示,6周辛伐他汀治疗明显增加了斑块内Foxp3的表达。同时,RT-PCR和western blot的结果也显示,Foxp3的mRNA和蛋白的表达在辛伐他汀组较对照组明显增加,从而证明了辛伐他汀可增加颈动脉斑块内Tregs的数量。此外,我们发现Tregs相关的细胞因子TGF-β和IL-10的mRNA和蛋白的表达在辛伐他汀组较对照组明显增加。4.3Tregs改变颈动脉斑块内细胞因子的表达免疫组化结果显示,与对照组相比,辛伐他汀明显提高了颈动脉斑块内IL-4蛋白的表达,而降低了IL-1β、IL-17和IFN-γ蛋白的表达。RT-PCR结果显示,与对照组相比,辛伐他汀明显提高了颈动脉斑块内IL-4mRNA的表达,而降低了IL-1β、IL-17和IFN-γ mRNA的表达。3.4Tregs对循环中细胞因子的影响ELISA结果显示,与对照组相比辛伐他汀明显提高了血清中抗炎因子IL-10的水平浓度,而降低了促炎因子IFN-γ和IL-17的水平。3.5辛伐他汀促进ACS患者外周循环中Tregs的数量和功能流式细胞仪分析结果发现10μM的辛伐他汀较对照组明显提高了Tregs占CD4+T细胞的比率。虽然1μM的辛伐他汀轻度提高了Tregs占CD4+T细胞的比率,但与对照组相比未达到统计学差异。Tregs的功能试验发现10μM的辛伐他汀较对照组明显提高了Tregs对CD4+CD25-T细胞的抑制率,而1μM的辛伐他汀组与对照组则相比则无明显差异。因此,辛伐他汀明显提高了ACS患者外周血中Tregs的数量和功能。5结论(1)在ApoE-/-小鼠的AS斑块模型中首次证明了他汀类药物提高了AS斑块内Tregs的数量和相关细胞因子的表达,调节了Th1/Th2/Th17的平衡。(2)他汀类药物明显提高了ACS患者外周血中Tregs的数量和功能。(3)他汀对AS斑块的稳定作用可能部分是通过Tregs的活化。1背景腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是一种慢性血管退行性疾病,主要发生于60岁以上的老年人群,严重威胁人类的健康。动脉瘤发生后逐渐扩大,最后破裂出血而导致患者的死亡。目前,AAA具体的发病机制并没有得到完全的阐明,也没有发现特效的治疗药物,治疗方式仍仅限于腔内或有创的手术治疗。但是并非所有的患者都适合手术治疗,动脉瘤直径较小(<5cm)、无症状的患者和无法耐受手术的高龄患者因无法从手术治疗中获益而失去了彻底治愈AAA的机会。因此找到一种有效而且安全的药物治疗的策略就显得格外重要。AAA主要的病理学改变为动脉中层弹力蛋白结构的破坏,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)勺过度降解,血管壁平滑肌细胞的减少和炎症细胞的浸润。ECM对于维持血管腔的完整和功能有重要的意义,ECM的过度降解有助于动脉管壁的扩张,在AAA的形成中发挥了关键的作用。炎症过程贯穿于AAA形成和发展的始终,动脉瘤组织中发现炎症细胞浸润和炎症因子分泌的明显增加。炎症细胞的大量浸润促进了炎症因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的释放,交织成特定的炎性网络,有助于管壁组织的破坏,导致最终的管壁变薄和扩张。MMPs,特别是MMP-2和MMP-9是动脉瘤内主要的蛋白水解酶,其对ECM的降解是AAA发病的主要机制。动物实验证明炎症反应的减弱和MMPs释放的减少可抑制AAA的形成。研究发现AAA具有许多自身免疫性疾病的特点,提示免疫系统参与了AAA病理过程。调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)是一类特殊CD4+T细胞亚群,在调节免疫系统平衡、维持机体内环境的稳定以及控制自身免疫性疾病的进展中发挥了重要作用。Tregs数量缺失或功能失活会破坏机体免疫内环境的平衡,导致自身免疫和炎症反应的无限放大。血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)诱导AAA形成的动物模型已经在ApoE-/-小鼠中成功的建立。免疫系统在AAA形成中已经受到关注,但是,对于Tregs是否对AAA形成造成影响并未有研究报道。2目的(1)在ApoE-/-小鼠中构建AngⅡ诱导AAA的动物模型。(2)观察Tregs是否预防在ApoE-/-小鼠中持续滴注AngⅡ所诱导的AAA形成。(3)探讨Tregs预防AAA形成的内在分子机制。3方法3.1Tregs的分选无菌分离8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾细胞,制备单个脾细胞悬液,利用磁珠分选技术制备纯化的Tregs。根据分组要求将Tregs溶于无菌生理盐水中。3.2动物模型的建立12周龄雄性ApoE-/-小鼠150只随机分为5组(每组30只),A:Control组(尾静脉注射200μl PBS); B:小剂量Tregs治疗组(small-dose Tregs组,SD组,尾静脉注射105Tregs); C大剂量Tregs台疗组(large-dose Tregs组,LD组,尾静脉注射106Tregs); D:PC治疗组(在尾静脉注射106Tregs的同时腹腔注射100μg PC61)。两周后上述操作重复一次。E：盐水组。第一次注射后第二天,将植入式胶囊渗透压泵埋藏于小鼠皮下,AngⅡ(1000ng/kg/min)(A、B、C和D组)或等量生理盐水(E组)持续恒速泵入28天,并全程给予高脂饮食喂养。3.3血压测量ApoE-/-小鼠血管紧张素Ⅱ注射前及注射后4周,每周利用小鼠测压仪进行血压的测量,每只实验动物测量3次后取其平均值。3.4组织病理学的检测AngⅡ或盐水治疗28天后,给予所有ApoE-/-小鼠安乐死,并留取腹主动脉标本观察AAA形成率,分型,并测量腹主动脉(肾上动脉段)的最大直径。制备腹主动脉的冰冻切片,行H&E、Verhoeff弹力纤维染色,免疫组织化学的方法检测肾上段腹主动脉内MOMA-2、SMCs、MCP-1、IL-6、MMP-2、MMP-9和COX-2的表达,同时行DHE和TUNEL检测。3.5细胞培养首先利用磁珠分选技术将Tregs和CD4+CD25-T细胞从健康人群外周血单核细胞中游离。人血管平滑肌细胞随机分为5组：Control组(未做任何处理)；CD25-组(每孔细胞培养基中加入5×105CD4+CD25-T细胞)；Tregs组(每孔细胞培养基中分别加入1.25×105,2.5×105and5×105Tregs)。在anti-CD3抗体(50ng/ml)存在的情况下共培养48小时后,加入AngⅡ(1μM)继续刺激24小时。3.6RT-PCR收集小鼠腹主动脉组织或各组平滑肌细胞,提取RNA,检测腹主动脉内MCP-1、 IL-6、MMP-2和MMP-9以及平滑肌细胞内MCP-1、IL-6、ICAM-1、MMP-2和MMP-9mRNA的表达。3.7Western blot收集小鼠腹主动脉组织或各组平滑肌细胞,提取蛋白,检测颈动脉内IL-10、 ICAM-1、MMP-2和MMP-9以及平滑肌细胞内MCP-1、IL-6、ICAM-1、 MMP-2、MMP-9、 FasL、COX-2和NF-κB蛋白的表达。3.8ELISA检测收集细胞上清,检测IL-10的水平浓度。4结果4.1ApoE-/-小鼠血压变化与单纯注射盐水组相比,4组AngⅡ输注的小鼠SBP均显著升高,Tregs的输入后对SBP无影响。4.2Tregs对AAA形成的影响AngⅡ输注28天后,各组AAA的发生率分别为对照组80%,SD组76%,LD组27%和PC组71%,而单纯盐水组无AAA形成。我们观察了实验各组AAA的分型,发现对照组、SD组和PC组AAA大多是Ⅲ或者Ⅳ型,而LD组则是Ⅰ型居多。对肾上腹主动脉的最大直径的测量发现,LD组腹主动脉的最大直径明显低于对照组、SD组和PC组。因此,Tregs可剂量依赖性的降低AAA的发生率和严重性。4.3HE和Verhoff弹力纤维染色AAA动脉壁弹力纤维断裂、中断,外膜增生肥厚,动脉管壁变薄,呈瘤样扩张,可伴有血栓形成,LD组则部分的逆转了AngⅡ诱导的动脉管壁组织学的变化。4.4Tregs对动脉瘤细胞构成的影响免疫组化方法证实,LD组巨噬细胞含量明显低于对照组、SD组和PC组；平滑肌细胞的含量则明显高于对照组、SD组和PC组。4.5Tregs对炎症和抗炎因子表达的影响LD组肾上段腹主动脉组织促炎因子MCP-1、IL-6和ICAM-1mRNA和蛋白的表达明显低于对照组、SD组和PC组。体外实验中, Tregs组MCP-1、IL-6和ICAM-1mRNA和蛋白的表达则明显低于对照组和CD25-组。另一方面,LD组肾上段腹主动脉组织抗炎因子IL-10蛋白的水平明显高于对照组、SD组和PC组。体外实验中,Tregs组IL-10的水平明显高于对照组和CD25-组。4.6Tregs降低MMP-2和MMP-9的表达体内试验中,RT-PCR、免疫组织化学和western blot检测肾上段腹主动脉组织,发现LD组MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达较对照组、SD组和PC组明显下降。体外实验中,Tregs组MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和CD25-组。4.7Tregs减少ROS的产生DHE方法检测肾上段腹主动脉组织ROS的表达,发现对照组、SD组和PC组的组织伴有较强的红色荧光,而LD组红色荧光则相对较弱,差异具有显著性意义。4.8Tregs减少平滑肌细胞凋亡体内试验中,TUNEL阳性细胞数量在LD组较对照组、SD组和PC组明显降低。体外试验中,AngⅡ刺激SMCs后,Tregs组FasL蛋白表达水平较对照组和CD25-组显著下降。4.9Tregs抑制COX-2的表达COX-2蛋白的表达在LD组较对照组、SD组和PC组明显降低。体外实验中,COX-2蛋白的表达在Tregs组较对照组和CD25-组明显下降。4.10Tregs抑制NF-κB通路的活化Tregs组NF-κB p65蛋白的表达较对照组和CD25-组明显降低。5结论(1)在ApoE-/-小鼠持续滴注的Ang II所诱发的AAA模型中,首次证明了外源性Tregs输入降低AAA的发生率和严重性。(2) Tregs抑制AAA形成的机制包括减少促炎因子和MMP-2、MMP-9释放,促进抗炎因子的分泌,抑制机体局部炎症和氧化应激反应,减少平滑肌细胞的凋亡,以及抑制NF-κB信号通路。 

 

【关键词】 动脉粥样硬化； 调节性T细胞； 应激； 斑块破裂； 他汀； Foxp3； 动脉瘤； 免疫系统； 巨噬细胞； 炎症；