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图 3 DLC-1 基因结构域对HT29 细胞克隆形成的影响 (A)克隆形成，(B)半定量统计；a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29. * P<0.05 Fig. 3 DLC-1 gene domain effected on the colony formation of HT29 cell. (A) The 145 colony formation, (B) The semiquantitative analysis; a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29. * P<0.05 2.3 DLC-1 基因结构域对HT29 细胞凋亡的影响 150 流式细胞仪检测HT-29 细胞凋亡，如图4 所示，pCDNA3.1-DLC1-HT29 全长转染组与 对照组、空载组细胞相比，早期凋亡细胞（Q4）显著增加（P<0.05）。而pcDNA3.1- ΔRhoGAP-HT29 转染组早期凋亡细胞与对照组、空载组无明显差异（ P>0.05 ）； pcDNA3.1-ΔSTART -HT29 转染组早期凋亡细胞较对照组和空载组增加，较全长转染组则降 低（P<0.05）；pcDNA3.1-ΔSAM-HT29 转染组早期凋亡细胞较全长转染组增加（P>0.05） 155 （表2）。 图4 DLC-1 基因结构域对HT29 细胞凋亡的影响 a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29. Fig. 4 DLC-1 gene domain effected on the apoptosis of HT29 cell. a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; 160 e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29. 表2 DLC-1 基因结构域对HT-29 细胞凋亡的影响 Tab. 2 DLC-1 gene domain effected on the apoptosis of HT29 cell 组别 Q1(%)( X ±s) Q2(%)( X ±s) Q3(%)( X ±s) Q4(%)( X ±s) HT29 2.8±0.07 3.5±0.56 87.9±1.37 5.8±0.60 pcDNA3.1-HT29 1.9±0.06 3.4±0.49 88.4±2.02 6.2±0.44 pcDNA3.1-DLC1-HT29 2.4 ±0.12 11.2 ±0.52 71.7 ±2.12 14.7±0.75** pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 2.2±0.05 2.9±0.81 89.2±2.39 5.7±0.51 pcDNA3.1-ΔSTART-HT29 1.8±0.10 9.1±0.92 79.9±1.65 9.2±0.37* pcDNA3.1-ΔSAM-HT29 1.3±0.09 7.5±0.78 69.3±1.87 21.9±0.82* 165 ** vs HT29, pcDNA3.1-HT29, pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29, P<0.05; * vs pcDNA3.1-DLC1-HT29, P<0.05. 2.4 DLC-1 基因结构域对RhoA 活性的影响 RhoA是Rho 家族蛋白的重要成员，推测是DLC-1 内在的Rho 蛋白GTP 酶活化蛋白（Rho GTPase activating protein, RhoGAP）结构域作用的主要靶点。故本实验首先通过Pull-down 170 assay 检测RhoA 蛋白活性，并以总RhoA 表达量为校正，结果如图5 所示，与对照组、空 载组相比，pCDNA3.1-DLC1-HT29 全长转染组细胞活性RhoA 蛋白（GTP-RhoA）表达明 显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。而pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 细胞活性RhoA 表 达与对照组、空载组无明显差异（P>0.05）；pcDNA3.1-ΔSTART -HT29 转染组活性RhoA 表达较对照组和空载组降低，较全长转染组则增加（P<0.05）；pcDNA3.1-ΔSAM-HT29 细 175 胞较全长转染组活性RhoA表达亦显著下降（P<0.05）。 图 5 DLC-1 基因结构域对RhoA 活性的影响 (A) Pull-down assay，(B)半定量统计；a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29. * P<0.05 Fig. 5 DLC-1 gene domain effected on the activity of RhoA. (A) Pull-down assay, 180 (B) The semiquantitative analysis; a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29. * P<0.05 3 结果 185 对 DLC-1 基因抗肿瘤的机制，最初的认识源于其内在的RhoGAP 结构域[6]，Rho 蛋白 GTP 酶活化蛋白（RhoGAP）能提高Rho 家族蛋白自身内源性的GTP 酶活性，使GTP 水解 成GDP，从而使Rho 家族蛋白由活性形式变为非活性的形式。Rho 家族蛋白是Ras 超家族 的小G 蛋白，具有与GTP 和GDP 结合的特性，GDP 结合状态的Rho 蛋白无活性，而与 GTP 结合的Rho 蛋白才具有活性，从而发挥分子开关的作用[7-9]。迄今，鉴别出来的Rho 190 家族蛋白共有58 种，最具代表性的三种成员是RhoA、Rac1和Cdc42蛋白（其中又以RhoA 研究最为充分）。DLC-1 基因沉默使GTP 酶活性下降，Rho 蛋白得以活化，从而向细胞内 持续传递生长信号，导致肿瘤发生[10]。本课题组前期研究已经证实，转染DLC-1 基因对HT29 细胞的抑制作用与RhoA 活性下调有关[11]。 本实验进一步证实RhoGAP 结构域在DLC-1 基因抑癌机制中的关键作用。通过MTT、 195 平板克隆实验及流式细胞术证实，DLC-1 基因全长转染引起HT29 细胞增殖抑制，凋亡增加， 而pcDNA3.1-ΔRhoGAP- HT29 亚克隆转染组细胞的增殖能力及细胞凋亡与对照组、空载组 相比均无明显差别，表明RhoGAP 结构域缺失的DLC-1 基因在一定程度上失去其抑制细胞 增殖能力，DLC-1 基因在HT-29 细胞中发挥抑癌作用具有RhoGAP 依赖性。并且， pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 亚克隆转染组细胞的RhoA 蛋白活性较DLC-1 基因全长转染组 200 明显增强，与对照组及空载组相比无明显差别，进一步证实RhoGAP结构域通过影响RhoA 信号通路发挥抑癌基因作用。 近来陆续也有文献报道，RhoGAP 功能失活的DLC-1 突变体仍然具有一定的抑癌基因 功能[12]；DLC-1 可与炎性蛋白（pro-inflammatory protein）S100A10 结合，抑制肺癌细胞侵 袭能力和致瘤性，此过程对RhoGAP 活性无影响[13]。提示DLC-1 发挥抑癌基因功能存在 205 RhoGAP 非依赖性机制，DLC-1 基因的其他结构域亦引起关注。 SAM 结构域可相互作用，形成同源二聚体，也可与其他蛋白，RNA，DNA 相互作用[14]。 Kim 等[15]报道，SAM 结构域可能是内源性RhoGAP 活性的自身抑制区域，敲除SAM 结构 域的DLC-1（DLC-1△SAM）转染乳腺癌细胞MDA-MB-468，GTP-水解活性是转染全长 DLC-1 序列的3 倍，同时转染DLC-1△SAM 到人胚肾HEK293 细胞引起的活性RhoA 表达 210 下降程度比转染全长DLC-1 引起的更多。这说明SAM 结构域对于DLC-1 内在的RhoGAP 水解活性起到负性调节作用。这与本实验的结果是一致的，敲除SAM 结构域的DLC-1 基因 亚克隆转染相对于DLC-1 基因全长转染组更显著的抑制了细胞增殖及RhoA 蛋白的活性， 增强凋亡。 START 结构域可与脂质（lipids）结合，但它们的具体作用尚不清晰[16,17]。还有研究表 215 明DLC-1 须定位于细胞内的粘着斑（focal adhesion localization）[18]，进而才能发挥抑癌基 因功能，而START domain 有助于DLC-1 的粘着斑定位。本实验首次发现，敲除START 结 构域的DLC-1 基因亚克隆转染相对于DLC-1 基因全长转染组，细胞增殖、侵袭的抑制有所 恢复，凋亡细胞减少，且RhoA 蛋白活性、ROCK 活性均有所恢复，表明START 结构域可 能协助RhoGAP 结构域而起作用，具体作用途径尚需进一步研究明确。 220 总之，我们认为RhoGAP结构域是DLC-1 基因抗肿瘤的主要机制，RhoGAP扮演着Rho 家族蛋白负调控因子的角色，可能通过调控细胞周期关键因子的表达，抑制肿瘤细胞增殖。 同时，DLC-1 基因的START 和SAM 结构域可能通过与多种蛋白相互作用，发挥对RhoGAP 结构域的协同和拮抗作用，从而参与DLC-1 介导的肿瘤抑制作用。 225 [参考文献] (References) [1] Seng TJ, Low JS, Li H, et al. 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