DLC-1 基因结构域在抑制人结肠癌HT29
细胞增殖中的作用#
吴鹏1，吴平平2，李楠1，金治1，黄培林1**
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（200802860040）
作者简介：吴鹏，（1977-），男，主治医师，肿瘤分子病理学
通信联系人：黄培林，（1957-），男，教授，肿瘤分子病理学. E-mail: hpl@seu.edu.cn
5 （1. 东南大学医学院病理学与病理生理学系，南京 210009；
2. 江苏省肿瘤医院内科，南京 210000）
摘要：目的：探讨DLC-1 基因主要结构域在抑制人结肠癌HT29 细胞增殖中的作用。方法：构建DLC-1 基因结构域敲除的亚克隆重组质粒，并转染至大肠癌HT29 细胞株；应用MTT、
平板克隆实验检测细胞增殖的改变；流式细胞术检测细胞凋亡；pull-down 方法分析RhoA10 蛋白活性。结果：转染成功后，pcDNA3.1-DLC1-HT29细胞增殖及RhoA 蛋白活性与对照组及
空载组相比明显抑制，细胞早期凋亡增加；pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 亚克隆转染组细胞的增殖能力、细胞凋亡及RhoA 蛋白活性与对照组及空载组相比均无明显差别；pcDNA3.1-Δ
SAM- HT29 亚克隆转染组相对于DLC-1 基因全长转染组更显著地抑制了细胞增殖，诱导凋亡，RhoA 蛋白活性下调；pcDNA3.1-ΔSTART- HT29 亚克隆转染组相对于DLC-1 基因全长转染组，
15 细胞增殖能力增强，凋亡细胞减少，RhoA 蛋白活性上调。结论：DLC-1 基因抑制HT-29 细胞殖具有RhoGAP 依赖性，SAM 结构域可能是内源性RhoGAP 活性的自身抑制区域，START 结
构域可能协助RhoGAP 结构域起作用。
关键词：肝癌缺失基因-1；RhoGAP 结构域；SAM 结构域；START 结构域；HT29 细胞株
中图分类号：R735.3
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Biological role of DLC-1 gene domain in its inhibition of
human colon cancer HT-29 cell proliferation
Wu Peng1, Wu Pingping2, Li Nan1, Jin Zhi1, Huang Peilin1
(1. Department of Pathology and Physiopathology, School of Medicine, Southeast University,
25 NanJing 210009;
2. Department of Internal Medicine, Neoplasm Hospital of Jiangsu Province, NanJing 210000)
Abstract: Objective: To study the role of three main domains of DLC-1 gene in its inhibition of
human colon cancer HT-29 cell proliferation. Methods: Recombinant plasmid vectors which
contains the whole cDNA and RhoGAP, SAM or START deleted domain of DLC-1 gene were
30 constructed and transfected into human colon cancer cell line HT-29. MTT assay, colony
formation and flow cytometry were used to test cellular biological behaviour. The PhoA protein
activity was detected by pull-down assay. Results: As compared to HT29 and pcDNA3.1-HT29
cells, cells proliferation, RhoA activity were significantly reduced, and early apoptosis was
enhanced in pcDNA3.1-DLC1-HT29 cells (P<0.05), while pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 cells
35 proliferation, apoptosis and RhoA activity showed undifference (P>0.05). Furthermore, as
compared with pcDNA3.1-DLC1-HT29 cells, cells proliferation and RhoA activity of
pcDNA3.1-ΔSAM-HT29 were significantly inhibited (P<0.05), and cells apoptosis were enhanced
(P<0.05); cells proliferation, RhoA activity of pcDNA3.1-ΔSTART-HT29 cells were significantly
increased and cells apoptosis were significantly reduced (P<0.05). Conclusion: The tumor
40 suppressor role of DLC-1 gene in HT-29 cells was RhoGAP-dependent, which may function by
affecting the RhoA pathway. SAM domain may be endogenous inhibition of RhoGAP activity,
and START domain may support the role of RhoGAP domain, the clear pathway needs further
study.
Keywords: DLC-1; RhoGAP domain; SAM domain; START domain; HT-29 cell line
 0 引言
肝癌缺失基因-1（frequently deleted in liver, DLC-1），位于人类染色体8p21.3-22，是一
个新型抑癌基因，研究表明其在多种人类肿瘤中表达下降或缺失，并可抑制多种肿瘤细胞增
殖和致瘤性[1]。本课题组前期实验证实DLC-1 在结直肠癌中发挥抑癌基因作用，通过基因
转染技术，将外源性DLC-50 1 cDNA导入DLC-1 阴性表达的HT-29 细胞，抑制结肠癌HT29
细胞的增殖和侵袭，引起细胞周期G1 期阻滞并诱导凋亡[2]。DLC-1 基因由三个主要结构域
SAM（Sterile alpha motif)、RhoGAP（Rho GTPase activating protein) 和START（steroidogenic
acute regulatory-related lipid-transfer domains) 构成[3]，本实验进一步研究DLC-1 基因各结构
域在大肠癌发生发展中的作用及机制。
55 1 材料与方法
1.1 材料与细胞株
结直肠癌 HT29 细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。RPMI-1640 培养基购自
Gibco 公司；新生小牛血清购自杭州四季青公司。G418 购自Sigma 公司；原核细胞表达载
体pCMV-SPORT6，Amp 抗性购自RZPD 公司；Trizol 细胞裂解液、脂质体Lipofectamine2000
60 购自Invitrogen公司；plasmid Midi Kit 购自QIAGEN 公司；重组人工基底膜Matrigel购自
美国BD 公司；Transwell Chamber（8μm 孔径）购自Costar 公司；限制性核酸内切酶Xba I、
BamH I，真核细胞表达载体pcDNA3.1，半定量RT-PCR 试剂盒均购自Takara 公司；引物由
Takara 公司合成。值得注意的是，我们选择扩增片段为393-654 位核酸序列的DLC-1 基因
引物时，位于敲除序列之外。
65 1.2 pcDNA3.1-DLC1 及各结构域敲除的亚克隆重组质粒的构建
以Xba I 和BamH I 酶切鉴定载体pcDNA3.1。合成带有Xba I 和BamH I 酶切位点的引
物， 上游序列： CTAGTCTAGATGTGCAGAAAGAAGCCGGACACC ATGATCCTAA
CACAAATTGAAGCCAAGGAAGC （ 下划线为Xba I 酶切位点） ， 下游序列：
CGCGGATCCTCACCTAGATTTGGTGTCTTTG（下划线为BamH 酶切位点）。PCR 扩增获
70 得DLC-1 基因全长cDNA，酶切消化DLC-1 基因PCR目的片段。DLC-1 基因目的片段PCR
产物连接入载体pcDNA3.1。
RhoGAP、SAM、START 结构域敲除的pcDNA3.1-ΔDLC1 质粒构建，测序鉴定，由南
京金思特生物公司完成。
1.3 脂质体法转染 HT-29 细胞以及稳定细胞系的筛选
75 具体步骤参见文献[4]。实验分为6 组：a. 野生型HT29细胞（对照组）；b. pcDNA3.1-HT29
细胞（空载组）；c. pcDNA3.1-DLC1-HT29 细胞（DLC-1 全长转染组）；d. pcDNA3.1-
ΔRhoGAP-DLC1-HT29 细胞（敲除RhoGAP 转染组）；e. pcDNA3.1- ΔSTART- DLC1-HT29
细胞（敲除START 转染组）；f. pcDNA3.1-ΔSAM-DLC1-HT29 细胞（敲除SAM 转染组）。
1.4 RT-PCR
80 提取细胞总RNA。RT-PCR反应检测DLC-1 基因mRNA按试剂盒说明进行，引物序列
见表1。PCR 条件：95℃预变性12min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共30
个循环，72℃延伸7min。产物用1.5%的琼脂糖进行电泳鉴定。
 表1 引物序列
Tab. 1 The sequences of Primer
引物名称 引物序列(5’-3’) 引物大小
DLC-1 sense GGACACCATGATCCTAACAC
antisense CTCATCCTCGTCTGAATCGT 262 bp
GAPDH sense CAATGACCCCTTCATTGACC
antisense TGGAAGATGGTGATGGGATT 135 bp
85
1.5 MTT 实验检测细胞增殖
取各组对数生长期细胞，以1×104 个/ml 单细胞悬液接种于96 孔板，每组细胞复种5 孔，
每孔200μl，置培养箱分别培养24、48、72、96、120h。加5mg/ml MTT 溶液（用0.01mol/L
PBS 配置）20μl，继续培养4h。弃去孔内的液体，加入150μl DMSO 充分溶解MTT 还原产
90 物，在酶标上振荡10min后读取波长为492nm的光密度值（D492）。按吸收度值计算各组
的D492 平均值及标准差，绘制细胞生长曲线，实验重复3 次。
1.6 平板克隆形成实验检测细胞克隆变化
取 1000 个细胞接种于六孔板中，每孔加2 ml 培养液。六孔板置于5%CO2、37℃、湿
饱和培养箱培养，静止培养2 周。弃去培养液，Giemsa 染色。计数克隆数。克隆形成率=
95 克隆数×100/接种细胞数。
1.7 流式细胞术检测细胞凋亡
收集各组细胞，预冷的PBS 洗涤2 次（2000r/min 离心5min），加入500μl Binding Buffer
悬浮细胞，再依次加入5μl Annexin V-FITC，5μl PI，混匀，室温下避光孵育10-15min，采
用FACSCalibur 流式细胞仪对样品进行检测，每次计细胞数10 000 个，激发波长488 nm，
100 分析软件cell-Quest计算凋亡率。
1.8 RhoA 蛋白活性检测
采用 pull-down 方法[5]提取细胞中以GTP 结合形式存在的活性RhoA 蛋白，继而进行蛋
白免疫印迹（Western blotting)分析。10%浓度聚丙烯酰胺行SDS-PAGE 电泳，而后将凝胶
上的蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1h，RhoA蛋白一抗(1:200
105 稀释) 4℃孵育过夜。洗涤后与二抗为HRP标记的兔抗小鼠IgG（1:2500稀释)作用，经ECL
底物化学发光显影。
1.9 统计学处理
实验数据采用 SPSS 11.0 统计软件进行析因、相关性分析。计数资料用Nonparametric
Tests 中的Independent Samples 过程，计量资料用Compare Means 中的One-Way ANOVA
110 过程。
2 结果
2.1 RT-PCR 检测基因转染结果
分 别提取HT29 、pcDNA3.1-HT29 、pcDNA3.1-DLC1-HT29 、pcDNA3.1-ΔRhoGAPDLC1-
HT29、pcDNA3.1-ΔSTART-DLC1-HT29 及pcDNA3.1- ΔSAM-DLC1-HT29 细胞RNA，
115 RT-PCR检测DLC-1 基因mRNA表达，结果显示，DLC-1 全长转染组和各亚克隆转染组的
HT29 细胞DLC-1 基因mRNA 恢复表达（图1）。提示转染成功。
 图1 转染后DLC-1 基因片段恢复表达a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c. pcDNA3.1-DLC1-HT29; d.
pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f. pcDNA3.1-ΔSAM-HT29.
Fig. 1 Expression of DLC-1 gene fragment was renewed after transfection. 120 a. HT29; b. pcDNA3.1-HT29; c.
pcDNA3.1-DLC1-HT29; d. pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29; e. pcDNA3.1-ΔSTART -HT29; f.
pcDNA3.1-ΔSAM-HT29.
2.2 DLC-1 基因结构域对HT29 细胞增殖的影响
125 MTT实验结果显示，随着细胞培养时间的逐渐延长，在48 h 后pCDNA3.1-DLC1-HT29
全长转染组细胞增殖曲线增长幅度较对照组和空载组细胞降低（ P<0.05 ） 。而
pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 细胞增殖与对照组、空载组无明显差异（ P>0.05 ） ；
pcDNA3.1-ΔSTART -HT29 细胞增殖较对照组和空载组细胞降低，较全长转染组为高
（P<0.05）；pcDNA3.1-ΔSAM-HT29 细胞增殖较全长转染组降低（P<0.05）（图2）。
130
图2 DLC-1 基因结构域对HT29 细胞增殖的影响 各组细胞在96 孔板中分别培养24、48、72、96h、120 h，
而后加 20μl 5mg/ml MTT 孵育 4 h。
Fig. 2 DLC-1 gene domain effected on the proliferation of HT29 cell. Groups of cells were cultured in 96-well
plates at various time points (24, 48, 72, 96 and 120 h). MTT (5 mg/ml, 20μl) was added, and cultured 4 h.
135
平板克隆实验结果也显示，全长转染组与对照组和空载组相比，其克隆形成的数目显著
减少（P <0.05）。而pcDNA3.1-ΔRhoGAP-HT29 细胞克隆形成与对照组、空载组无明显差
异（P>0.05）；pcDNA3.1-ΔSTART -HT29 细胞克隆形成较对照组和空载组细胞降低，较全
长转染组为高（P<0.05）；pcDNA3.1-ΔSAM-HT29 细胞克隆形成较全长转染组降低（P<0.05）
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