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225 猪胎儿细胞三维立体培养时，添加皮质醇作为刺激因子，有助于其用于生物人工肝。 尽管采用猪肝细胞附着于微载体培养，其来源广泛，是构建生物人工肝的常用方法。但 其毕竟是异种肝细胞，人体对猪肝细胞的免疫反应可能降低生物人工肝的功能。而且在细胞 功能方面有一定的缺陷，仍然存在着传染病毒的潜在危险。如何克服这些不足将是这一领域 研究的重点和难点。 230 对所使用猪肝细胞进行基因转染，避免或减弱免疫反应是一种可行的解决方案。 Kawashita 等[35]采用日本血球凝集病毒阳离子脂质体作为运载体，对微载体附着培养的猪肝 细胞进行基因转染，并测定其功能参数。结果显示，与传统的脂质体转染法相比，其转染活 性可提升100 倍；且操作简单，不需延长细胞培养周期。转染后的猪肝细胞细胞膜完整，未 见明显的细胞损伤，保持了良好的细胞功能。这一方法为大量转染猪肝细胞，用于临床生物 235 人工肝构建提供了可能。 使用猪肝细胞构建生物人工肝支持系统存在争议。其中不可忽视的一点就是不同生物种 类间的生理不相容性。一些临床研究中，肝细胞对细胞因子的种属特异性反应，以及外源性 代谢产物对肝细胞的影响可能对猪肝细胞构建的生物人工肝的效能受到限制。Schrem 等[36] 针对这一问题进行研究，分析了种属特异性细胞因子在单独和共同培养中对肝细胞功能的影 240 响。试验所用肝细胞分别来自人切除手术后样本和蓝瑞斯猪。以人类和猪的白介素-6 和肿 瘤坏死因子-α作为影响因素，检测了C 反应蛋白、白蛋白以及CCAAT/增强子结合蛋白α、 β的变化情况，并考察了与细胞活性相关的睾酮代谢物的浓度。白介素-6 给药后，人肝细 胞C 反应蛋白浓度提高远超过猪肝细胞。白介素-6 和肿瘤坏死因子-α会减少白蛋白分泌， 但人肝细胞与猪肝细胞对其反应水平不同。在白介素6 作用下，与人肝细胞相比，猪肝细胞 所分泌6α-245 和7α-羟睾酮较少。肿瘤坏死因子-α对于人肝细胞和猪肝细胞6β-羟睾酮分泌 分别起到诱导和抑制作用。在可自由交换代谢产物的共同培养试验中，猪肝细胞产生较少的 6α和16α-羟睾酮；而人肝细胞在白介素-6 作用下，其C 反应蛋白基因和蛋白表达减少。 在缺乏人肝细胞来源的情况下，使用肝细胞系构建生物人工肝也是一种可行的方法，但 需考虑其是否能充分满足治疗所需的功能性。在生物反应器中合并使用几种不同细胞系使其 250 功能互补有助于弥补这一缺陷。 人类胚胎干细胞可用适宜的细胞外基质和生物材料进行三维立体培养，并诱导分化产生 肝脏内胚层，从而成为生物人工肝构建的细胞来源。最近的研究发现，通过将多能性基因转 染入体细胞，产生多能干细胞，可达到对不同患者的针对性设计。将其用于生物人工肝构建 可有效减少并发症的发生，从而有望在人类肝病治疗及相关毒物预测中发挥重要作用[37]。 255 Kobayashi等[38]分别研究了诱导分化人胚胎干细胞成肝细胞和使用可逆永生人类肝细胞 系构成生物人工肝，并用其对药物诱导的急性肝衰竭猪进行治疗。试验测定，人胚胎干细胞 经诱导分化成肝细胞后，能够分泌白蛋白并代谢氨和利多卡因。经生物人工肝治疗，实验动 物血氨和炎症因子水平的升高受到抑制，肝衰动物存活率显著提高。 生物人工肝系统区别于其他治疗方法的一大优势就是其对于代谢功能的改善，这也是设 260 计构建生物人工肝时需要重点考虑的一个方面。Omasa 等[39]针对肝脏药物代谢功能构建了 一种生物人工肝支持系统。对谷氨酰胺合成酶基因进行重组，可改善CHO 细胞和人肝肿瘤 细胞系HepG2 细胞进行氨代谢的功能。利用含谷氨酰胺合成酶基因和CYP3A4 药物代谢基 因的pBudCE-GS-CYP3A4 载体, 对HepG2 细胞系进行改造。所得到的GS-3A4-HepG2 细胞 系，其CYP3A4 活性高于人类肝实质细胞。使用改造后的细胞构建生物人工肝，其药物代 265 谢活性，即生物人工肝清除率更高。 采用占人类肝脏70%的肝细胞来构成生物人工肝，除受到来源短缺的限制外，另一方 面，在体外单纯培养人肝细胞会造成其肝脏特异性表达的迅速丧失，其表达缺乏稳定性。一 种可能的解决方法是通过添加适合的细胞外基质和生长因子，将肝细胞与肝脏中其它种类细 胞共同培养。肝实质细胞与非实质细胞及胆管上皮细胞的相互作用对保持其活性具有重要意 270 义。 Wen 等[40]设计了一种二元隔室灌流生物反应器，实现了在不直接接触的前提下，共同 培养肝细胞和肝脏星形细胞T6。这一生物反应器在为细胞提供三维生长空间条件的同时， 可针对两种细胞各自需求采用相应的培养条件。与单纯培养肝细胞相比，细胞分化良好，具 有较高的白蛋白分泌，尿素代谢及细胞色素P450 酶活性水平。 275 目前，采用新鲜或冷冻保存的猪肝细胞作为材料是构成生物人工肝的常用方法，并已经 在一期临床试验上证明了其安全性，可操作性以及对各项临床生化指标的改善作用。但进一 步的临床研究发现采用猪肝细胞生物人工肝治疗并未显著改善存活率。采用猪肝细胞治疗的 种种缺点以及人类肝细胞的来源短缺，使得对新的细胞来源的研究具有重要意义。构建具有 功能性，有效性，无免疫原性的人肝细胞系的研究正在进行中，包括人类肝肿瘤衍生细胞系， 280 永生化的胎儿及成人肝细胞，肝脏干细胞，造血干细胞及胚胎细胞等。但至今为止体外诱导 分化所得细胞均无法完全替代正常肝细胞的功能。对于分化促进因子，基质及培养条件的研 究有助于改变这一现状[41]。 4 结论与展望 对于肝功能衰竭这一高致死性疾病，采用生物人工肝是一种具有潜力和优势的治疗方 285 法。微载体作为一种广泛应用于生物医学领域的技术工具用于肝细胞培养和生物反应器构 建，有利于在体外保持肝细胞活性及其特异性功能，并改善肝细胞培养状态和增殖效率。微 载体培养肝细胞与中空纤维型生物反应器相结合是目前最有效的技术方法。猪肝细胞由于其 易于获得，代谢功能与人肝细胞相接近等优点，常作为人肝细胞的替代品广泛应用于生物人 工肝构建。但其免疫反应，生理不相容性等缺陷影响了生物人工肝功能的发挥。采用猪肝细 290 胞治疗的种种缺点以及人类肝细胞的来源短缺，使得对新的细胞来源的研究，特别是构建适 用的人源肝细胞系的研究仍将是生物人工肝研究的热点。 [参考文献] (References) [1] Bernuau J, Rueff B, Benhamou J P. 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