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120 机械损伤。张立国[17]等采用乳化交联法制备了果糖修饰的壳聚糖微载体，并在其上培养原 代大鼠肝细胞。对制备工艺进行考察，发现壳聚糖溶液浓度和交联剂戊二醛用量是影响微载 体密度的主要因素。随着壳聚糖溶液浓度和戊二醛用量的增加，微载体的密度也随之增加。 细胞培养试验显示肝细胞在果糖修饰的壳聚糖微载体上聚集生长，保持良好的球形形态，与 对照组比较，肝细胞白蛋白分泌功能和葡萄糖代谢活性得到了显著改善。 125 具有良好的细胞亲和性有利于在微载体上大量培养功能性强的肝细胞，用于构建生物人 工肝。Kobayashi[18]等开发了一种包含(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸，GRGDS) 细胞黏附性肽链的纤维素微载体，进行了NKNT-3 人类永生肝细胞系的培养试验。结果显 示，通过相差显微镜和扫描电子显微镜观察，可见细胞种植6h 后即可黏附于微载体上，至 48h 细胞高密度附着生长并形成聚集团块，细胞功能良好可见突出的微绒毛，提示该微载体 130 细胞亲和性良好。 具有生物可降解性以及生物相容性的材料是近年来的研究热点，其用于微载体构建具有 明显的优点。Xu 等[19]选择具有生物可降解性以及生物相容性的合成材料PLGA(聚乳酸-乙 醇酸共聚物)，采用超声雾化法分别制备了直径20–40μm 和 100–300μm 的微载体，并研 究了人肝细胞系HepG2 细胞和成熟啮齿动物肝细胞在胶原包被的微载体表面附着生长的情 135 况。结果显示，细胞可在微载体表面扩增并保持活性。 Werner 等[20]在CultiSpher-G 大孔微载体上培养人类永生肝细胞系HepZ，并尝试将其应 用于生物人工肝。试验结果显示，HepZ 细胞大量附着于微载体，进行生长扩增。微载体内 所附着细胞保持圆整的形貌，可检测到乳酸脱氢酶活性提升。扩增所得细胞团可体现肝脏的 主要代谢功能，有希望用于生物人工肝支持系统。 140 Xu 等[21]将Cytodex-3 微载体与中空纤维相结合，设计了一种灌注猪肝细胞的生物人工 肝系统。试验对比了Cytodex-3 微载体上、中空纤维内以及加入了微载体的中空纤维生物人 工肝中培养猪肝细胞的结果，分别以7 天培养周期里肝细胞活性，介质中丙氨酸氨基转移酶 和乳酸脱氢酶活性，尿素合成，地西泮转化，蛋白合成以及葡萄糖磷酸盐活度为评价指标。 结果显示，采用这种新型生物人工肝系统可产生少量丙氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶，并且 145 证明Cytodex-3微载体可提高肝细胞的解毒功能和蛋白合成功能。 微载体培养肝细胞用于生物人工肝支持系统，不仅可提供具有功能性的肝细胞团，改善 患者代谢，而且可从体液水平和分子机制上促进原有肝细胞的增殖和发挥器官特异性功能。 Suh 等[22]发现暴发性肝衰竭大鼠肝细胞无法再生与肝细胞生长因子和肝细胞生长因子受体 c-met 的延迟表达，以及肝细胞生长因子和转化生长因子-β1 在血液中浓度升高有关。用生 150 物人工肝进行治疗，可加速肝细胞生长因子和c-met mRNA在肝脏的表达，降低血液中肝细 胞生长因子和转化生长因子-β1 的浓度，延长试验组大鼠的存活时间。经治疗大鼠综合参 数得到改善，保持较高的身体核心温度，残留肝脏部分可检测到较高的肝细胞增殖率和特异 性功能基因表达。 2.2 微载体在构建生物反应器中的应用 155 Naruse 等[23]对生物人工肝支持系统治疗肝衰竭患者的研究和应用情况进行了调查。体 外肝灌注循环和生物反应器系统是两种主流的生物人工肝支持系统。体外肝灌注循环具有安 全性和易操作性的特点。但其需要大量的人工劳动，从而进一步加重了患者的经济负担。因 此，使用生物反应器构建生物人工肝系统的研究，具有更好的实用性和应用潜力。微载体用 于肝细胞培养，有利于体外培养的条件下保持细胞的活性和功能，以及在生物反应器内有限 160 的空间中提高细胞培养的效率。将肝细胞附着培养在微载体上，再灌注入生物反应器内，是 一种高效实用的方法。 Iwahori 等[24]用多孔纤维素微载体构成了柱状生物反应器，在此辐向流动反应器中介质 由边缘向中心流动，从而保证了不同位置细胞供氧和营养物质的均匀性。利用这一生物反应 器分别灌注培养人肝癌细胞和近端肾小管细胞，构成生物人工肝、肾，研究结果表明在高密 165 度培养的条件下细胞保持了长期活性。对一些代谢酶(包括肝癌细胞的尿素代谢相关酶以及 细胞色素P450，近端肾小管细胞1α羟化酶)的mRNA 表达进行测定，结果显示与传统的单 层培养相比，采用辐向流动生物反应器，mRNA 表达水平显著提高，反映出良好的细胞功 能性。 生物反应器是BAL 的核心部件，生物反应器设计的主要目的在于保持肝细胞活力、功 170 能和分化状态，且不妨碍肝细胞营养及代谢产物的交换，同时还能起到治疗作用。因此，选 择合适的材料构建生物反应器，实现双向物质交流，是影响微载体附着肝细胞发挥功能的重 要因素。目前生物反应器大多制成中空纤维型，利用中空纤维承载大量扩增的肝细胞，构成 生物人工肝支持系统。这类生物人工肝支持系统的临床试验已经在欧洲和美国开始进行，并 将进一步发展[4, 25]。 175 中空纤维型生物反应器使用时，需将血浆灌注通过中空纤维毛细管柱，毛细管外的肝细 胞可与血浆相互作用。在次级回路中，血浆被分离，保温和补充氧气，之后通过生物反应器 中的毛细管。肝细胞与血浆进行自由分子交换，肝细胞从血浆中吸收氧和营养物质，提供代 谢产物和发挥解毒功能。使用中空纤维反应器构建生物人工肝系统，首先需解决肝细胞与中 空纤维的生物相容性问题。在中空纤维生物反应器中灌注附着生长肝细胞的微载体，既要保 180 证中空纤维材料无细胞毒性从而使细胞在微载体上大量扩增，又要避免细胞附着于中空纤维 上生长从而堵塞微孔，妨碍物质交换。彭承宏等[26]利用光化学接枝聚合材料表面改性技术， 将亲水性的活性官能团乙烯基单体-AM 引入微孔聚丙烯(micropore polypropylene, MPP)超滤 膜表面，改善了材料表面的亲水性，改变材料的生物相容性从而减少了对蛋白质的吸附。试 验结果显示，在cytodex-3 微载体上培养的人肝细胞L-02 难以在接枝MPP 表面黏附、铺展， 185 而自动黏附在与细胞有良好相容性的cytodex- 3 表面生长，且细胞活性保持良好，说明这一 技术适用于生物人工肝反应器的构建。 De Bartolo 等[27]将人原代肝细胞灌注入交叉中空纤维膜生物反应器，并重点考察了生物 反应器对细胞代谢功能的影响。交叉中空纤维膜的特点是将具有不同分子量和物理化学性质 的两种中空纤维—改性聚醚醚酮(PEEK-WC)和改性聚醚砜(PES)交叉装配，使其分别与流入 190 和流出的介质作用，通过将细胞附着在中空纤维网络上，实现以层间流动进行大量物质交换 的功能。与已有实验数据进行对比，可发现肝特异性产物(如白蛋白和尿素)及药物(如地西泮) 的转运状况良好。优化灌流条件，可在超过18 天的培养时间内，保持生物反应器内尿素合 成，白蛋白分泌，以及地西泮生物转化等肝脏特异性功能。尤其是较高的尿素合成速率和地 西泮生物转化能力，反映了生物反应器具有优良的性能。 195 Pazzi 等[28]使用由附着生长猪肝细胞的微载体所灌注的中空纤维与碳吸附柱共同构成的 生物人工肝对肝功能衰竭患者进行治疗，并测定了治疗前后患者血清胆汁酸的情况。研究发 现，使用生物人工肝治疗前，患者血清胆汁酸水平很高，易加重脏器损伤及诱发并发症。使 用生物人工肝治疗可降低血清胆汁酸浓度和疏水性，以及二羟基三羟基化合物的比例。通过 治疗，血浆中大部分的结合胆汁酸被清除。同时由试验结果可分析得出，相比于碳吸附柱， 200 附着于微载体上的猪肝细胞在清除胆汁酸，降低胆汁酸疏水性方面起了关键性的作用。 Gao 等[29]将吸附了肝细胞的微载体灌注入中空纤维构成生物人工肝系统用于猪的肝功 能衰竭模型，并进行了评价研究。通过对比试验组和对照组一系列生化指标，特别是氨浓度 和胆红素代谢相关指标的变化情况，说明了生物人工肝系统具有解毒和改善胆红素代谢的作 用，可为急性肝功能衰竭的治疗提供帮助。 Morsiani 205 等[30]在Cytodex-3微载体上附着培养猪肝细胞，并灌注入中空纤维生物反应器 构成生物人工肝系统。为了考察其代谢功能，在体外分别以含胆酸盐和牛磺胆酸盐的人血浆 在循环下表面灌流生物人工肝，并检测相关指标的变化。结果显示，生物人工肝系统具有清 除血浆中胆汁酸的作用，并能蓄积除去胆酸盐和牛磺胆酸盐。检测微载体上生长的肝细胞的 超微结构，其典型特征反映出细胞保持了良好的代谢活性。 210 3 构建生物人工肝应用的细胞材料 细胞材料是BAL 治疗基础，维持细胞活性和功能对BAL 功效有决定性作用。近年来的 研究结果已证实含细胞的生物人工肝对于不同种类动物的肝衰竭模型和一期临床病人的治 疗作用，安全性良好，神经学、血流动力学以及生物化学指标得到显著改善[31]。临床使用 生物人工肝进行肝衰竭治疗，需要为其提供充足的可大量生产的肝细胞来源。理论上正常人 215 的肝细胞用于填充生物反应器最为理想，但其来源短缺。常用的方法是采用动物肝细胞作为 替代品。与人肝细胞比较，猪肝细胞分离简单，可大量制备，细胞活力较好，细胞培养效果 良好。由于猪肝细胞的代谢功能(细胞色素P450 含量及其代谢能力)与人工肝细胞最为接近， 其混合氧化酶的高水平表达正是代偿肝衰竭解毒功能的重要基础，故猪肝细胞被公认是目前 生物人工肝较好的细胞材料，选择合适的体外培养条件有助于其功能的发挥[32, 33]。 220 Ehashi 等[34]进行了猪胚胎肝细胞长期三维立体培养试验，并与普通单层培养对比。为 了促进细胞生长和成熟，试验中分别添加了人致癌素M，白血病抑制因子和皮质醇，并对 其细胞增殖和肝特异性功能表达效果进行了检测。结果显示，各种刺激因子对细胞增殖影响 不大。单层培养时，白蛋白分泌功能衰退迅速至经过两周不可测。三维立体培养时，不同于 人致癌素M 和白血病抑制因子，添加皮质醇可在较长时间内保持细胞白蛋白分泌能力。在 学术论文网Tag： |
