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的振动吸收峰；1728 cm-1 为羰酯基的吸收峰；1637 cm-1 为普鲁兰糖环本身吸收峰；FITC 在 2015 cm-1 处异硫氰酸基团的特征吸收峰消失，表明异硫氰酸基团参与了反应。 135 2.1.2 FITC-CHSP 的核磁谱图 图2 核磁谱图 (a) 普鲁兰 (b) FITC (c) FITC-CHSP Fig.2.1H NMR spectrum of (a) pullulan, (b) FITC, and (c) FITC-CHSP CHSP 的1H NMR (DMSO-with TMS, 140 ppm) 在5.60-11.0 ppm 范围内无核磁峰。 FITC-CHSP (图2, b)的1H NMR：0.40-2.40 (胆固醇上的氢)，2.60-4.60 (glucose 2H、3H、4H、 5H和6H)，4.60 (glucose1Hα(1-6))，5.05 (glucose1Hα(1-4))，4.60-5.57(glucose，-OH)，5.60-8.2 (FITC 分子上的氢)， 10.16 (FITC，-COOH 即分子上羧基上的氢)；故由1H NMR 图谱可初步确证 FITC 化学键合到胆固醇基普鲁兰多糖长链上。由1.2.1 所述公式计算得到每100 个糖单元取 145 代4.3 个FITC。 2.2 FITC-CHSP 纳米粒的表征 动态光散射测得FITC-CHSP 纳米粒的平均粒径为（69.0 ±2.2）nm，粒径分布均匀。 图3. FITC-CHSP透射电镜照片 150 Fig.3. Transmission electron micrograph (TEM) of FITC-CHSP nanoparticles 透射电镜结果如图3 所示，表明FITC-CHSP 纳米粒为规则球形结构，其粒径约为60 nm， 远小于动态光散射实验测得的纳米粒在溶液中的粒径，这可能是TEM 样品制备过程中的干 燥过程引起纳米粒表面的塌陷所致。 155 2.3 体外细胞摄取实验 2.3.1 标准曲线的建立 以细胞裂解液为溶剂，配制FITC-CHSP 纳米粒的浓度梯度工作液，测定其荧光光度值， 以荧光光度值（F）对纳米粒的浓度（C）作图，结果发现，当纳米粒的浓度在1-40 μg/mL 范围内，F 与C 呈良好的线性关系，线性方程为F= 8.43C + 13.72（R2 = 0.9990）。 160 2.3.2 孵育时间对摄取的影响 图4 孵育时间对FITC-CHSP 纳米粒摄取的影响 Fig.4. Effect of incubation time on nanoparticle uptake at 37°C by HepG2. The concentration of nanoparticles used was 0.15 mg/mL. Data represents 165 mean ± SD (n= 4). 如图4 所示，在2 h 内，纳米粒的摄取量随着孵育时间的增加而增大，2 h 后，摄取量 趋于平稳，这可能是由于饱和所致，所以2 h 被选择后续研究。 2.3.3 FITC-CHSP 纳米粒浓度对摄取的影响 170 图5 FITC-CHSP纳米粒浓度对摄取的影响 Fig.5. Effect of concentration on nanoparticle uptake at 37°C by HepG2. Various nanoparticle concentrations ranging from 0.05 to 2 mg/mL were applied to HepG2 culture for 2 h. Data represents mean ± SD (n= 4). 175 如图5 所示，HepG2 细胞对FITC-CHSP 纳米粒的摄取量随着纳米粒浓度的增大而增大， 但是摄取率随着纳米粒浓度的增大而减小。 2.3.4 温度对摄取的影响 180 图6 温度对FITC-CHSP 纳米粒摄取的影响 Fig.6. Effect of temperature on nanoparticle uptake by HepG2. Two different temperatures 4°C and 37°C were used to evaluate the uptake of three different concentrations of nanoparticles (0.05, 0.15, and 0.25 mg/mL). Bars represent mean ± SD (n= 4). 185 如图所示， 不同浓度的FITC-CHSP 纳米粒与HepG2 分别在4°C 和37°C 孵育2 小时后， 4°C 时HepG2 对不同浓度FITC-CHSP 纳米粒的摄取量减少至37°C 对应浓度纳米粒摄取量 的15-17%，表明37°C 时，85%的FITC-CHSP 纳米粒是通过能量依赖的内吞途径进入细胞， 而剩余的15%的纳米粒则可能是通过物理吸附或扩散进入细胞。 2.4 内吞抑制实验 190 图7 几种内吞抑制剂（10 mM 叠氮化钠、6 μg/mL of 氯丙嗪、10 mM 甲基-β-环糊精以及50 μM 阿米洛利） 对HepG2 细胞摄取FITC-CHSP 纳米粒的影响，纳米粒的浓度为0.15 mg/mL。 Fig.7. Uptake of FITC-CHSP nanoparticles by HepG2 cells at 37°C (control) in the presence of 10 mM of sodium azide, 6 μg/mL of chlorpromazine, 10 mM M-β-CD, and 50 μM of amiloride. Incubation time was 2 h and the 195 dosing concentration was 0.15 mg/mL. Mean ± SD, n=4. 如图7 所示，与对照组相比，10 mM 叠氮化钠、6 μg/mL of 氯丙嗪和10 mM 甲基-β- 环糊精实验组分别使纳米粒的摄取量减少了24.0%、26.1%和39.7%，而50 μM 阿米洛利对 纳米粒的摄取没有显著影响(p > 0.05)。结果表明FITC-CHSP 纳米粒经HepG2 细胞的摄取是 200 一个能量依赖的过程，网格蛋白依赖性和小窝蛋白依赖性内吞途径均参与了该摄取过程。 3 结论 成功制备了FITC-CHSP 纳米粒，并对其进行了表征。摄取实验表明，纳米粒的浓度、 孵育时间以及温度均会对HepG2 摄取该纳米粒产生影响，内吞抑制试验表明网格蛋白依赖 性和小窝蛋白依赖性内吞途径均参与了该摄取过程。这为疏水改性普鲁兰纳米粒作为药物载 205 体或基因载体的进一步研究和实际应用提供理论依据。 [参考文献] (References) [1] Rekha M R, Sharma C P. Pullulan as a Promising Biomaterial for Biomedical Applications: A Perspective [J]. Trends Biomater Artif Organs, 2007, 20(2): 116-121. 210 [2] Leathers T D. Biotechnological production and applications of pullulan [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(5-6): 468-473. [3] Shingel K I. Current knowledge on biosynthesis, biological activity, and chemical modification of the exopolysaccharide, pullulan [J]. Carbohydr Res. 2004, 339(3): 447-460. [4] Kazunari A, Seiichi K, Shozo S, et al. Self-assembled hydrogel nanoparticle of cholesterol-bearing pullulan as 215 a carrier of protein drugs: Complexation and stabilization of insulin [J]. J Controlled Release, 1998, 54(3): 313-320. [5] Yang W Z, Chen H L, Gao F P, et al. self-aggregated Nanoparticles of Cholesterol-modified Pullulan Conjugate as a Novel Carrier of Mitoxantrone[J]. Current Nanoscience, 2010, 6(3): 298-306(9). [6] Jeong Y, Na H S, Oh J S, et al. Adriamycin release from self-assembling nanospheres of 220 poly(DL-lactide-co-glycolide)-grafted pullulan [J]. Int J Pharm, 2006, 322(1-2): 154-160. [7] Na K, Lee T B, Park K H, et al. Self-assembled nanoparticles of hydrophobically-modified polysaccharide bearing vitamin H as a targeted anti-cancer drug delivery system [J]. Eur J Pharm Sci [J]. 2003, 18(2): 165-173. [8] Zhang H Z, Gao F P, Liu L R, et al. Pullulan acetate nanoparticles prepared by solvent diffusion method for epirubicin chemotherapy [J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2009, 71(1): 19-26. 225 [9] Belder A N de, Granath K. Preparation and properties of fluorescein-labelled dextrans [J]. Carbohyd Res, 1973, 30: 375-378. [10] Olsson Y, Svensjӧ E, Arfors K E, et al. Fluorescein labelled dextrans as tracers for vascular permeability studies in the nervous system [J]. Acta Neuropathol, 1975, 33(1): 45-50. 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写MBA论文 代写博士论文 代写医学论文 |
