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胆固醇基-普鲁兰自组装纳米粒的体外 HepG2 细胞摄取研究# 蒋丽琴1，李学敏1，刘玲蓉1，张明明1，张其清1,2** 基金项目：博士点基金（编号：20101106110042） 作者简介：蒋丽琴，(1984-)，女，在读博士研究生，主要研究方向：纳米药物缓控释制剂。 通信联系人：张其清，(1954-)，男，研究员，博士生导师，主要研究方向：生物材料，组织工程，药物制 剂。E-mail: zhangqiq@xmu.edu.cn 5 （1. 中国医学科学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室，天津 300192； 2. 厦门大学生物医学工程研究中心，厦门市生物医学工程技术研究中心， 福建 厦门 361005） 摘要：目的：研究HepG2（人肝癌细胞）摄取胆固醇基-普鲁兰（CHSP）纳米粒的影响因素 和摄取机制。方法：采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记CHSP，透析法制备FITC-CHSP 纳 10 米粒，通过荧光光度法对经HepG2 细胞摄取的FITC-CHSP 纳米粒进行定量，研究纳米粒的 浓度、孵育时间以及温度对摄取纳米粒的影响。选用几种选择性的内吞途径抑制剂叠氮化钠、 氯丙嗪、甲基-β-环糊精和阿米洛利来考察FITC-CHSP 纳米粒经HepG2 摄取的机制。结果： 当温度为37℃，纳米粒浓度为0.15 mg/mL 时，纳米粒的摄取量随着孵育时间的增加而增大， 2 h 后摄取量趋于平稳。同时纳米粒的摄取量随着纳米粒浓度的增大而增大，但是摄取率减 15 小。在同等条件下，4℃时纳米粒的摄取量要明显低于37℃时的摄取量。抑制试验表明 FITC-CHSP 纳米粒经HepG2 细胞的摄取是一个能量依赖的过程，网格蛋白依赖性和小窝蛋 白依赖性内吞途径均参与了该摄取过程。结论：上述研究为深入揭示疏水改性多糖自组装纳 米粒子的入胞机制及其在医学上的安全应用提供了实验依据。 关键词：胆固醇基-普鲁兰纳米粒；人肝癌细胞；异硫氰酸荧光素；摄取 20 中图分类号：R735.7 Uptake of self-assembled cholesterol modified pullulan nanopaticles by HepG2 in vitro JIANG Liqin1, LI Xuemin1, LIU Lingrong1, ZHANG Mingming1, ZHANG Qiqing1,2 25 (1. Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, TianJin 300192; 2. Research Center of Biomedical Engineering Medical School, Xiamen University, FuJian XiaMen 361005) Abstract: Aim: To evaluate the influence factors and mechanism of uptake of 30 cholesterol-modified pullulan nanoparticles by HepG2 cells. Methods: FITC was conjugated to CHSP, and FITC-CHSP nanoparticles were prepared by dialysis. Uptake of FITC-CHSP nanoparticles by HepG2 cells was quantified by fluorometry, to investigate the effect of nanoparticle concentration, incubation time and temperature on the uptake. Meanwhile, several selective endocytosis inhibitors, chlorpromazine, methyl-β-cyclodextrin and amiloride were 35 selected to study the potential endocytosis mechanism. In vitro experiments with endocytic inhibitors suggested that clathrin-mediated endocytosis, and caveolae-mediated endocytosis were involved in the internalization of FITC-CHSP nanoparticles. Results: The uptake of FITC-CHSP nanoparticles by HepG2 cells at 37 ºC increased with the incubation time over a 2 h period and had no significant further increase beyond 2 h. Furthermore, the uptake of nanoparticles by HepG2 40 cells was found increased with increase in the concentration of nanoparticles, but the efficiency of uptake was reduced at higher doses. Besides, there was a significant reduction in nanoparticles uptake at 4°C. Conclusion: The study provides experimental evidence for revelation of the endocytosis mechanism of hydrophobically modified polysaccharides self-assembled nanoparticles and medical security application. 45 Keywords: Cholesterol-modified pullulan nanoparticles; Human hepatocellular carcinoma cell; Fluorescein isothiocyanate; Uptake 0 引言 普鲁兰是一种水溶性的中性直链多糖，由α-1,6 糖苷键连接的麦芽三糖重复单位组成。 由于该物质无毒、无免疫原性、无致突变作用、无致癌性及具有良好的生物相容性，且能够 50 被体内淀粉酶降解，使其在食品、医药、制造业和电子学方面具有广泛的用途[1-3]。近年已 有文献报道以普鲁兰多糖为亲水主链，连接疏水基团如胆固醇[4,5]、PLGA[6]、乙酰基[7,8]等形 成双亲性聚合物，以透析法自组装制备纳米粒。该纳米粒可用于包载疏水药物、蛋白及DNA 等，形成一种新型纳米载体。异硫氰酸荧光素(FITC)的生物相容性好、毒性小，采用二月桂 酸二丁基锡(DBTDL)作为催化剂，能有效合成FITC 标记的右旋糖酐[9,10]。而胆固醇基修饰 55 的普鲁兰（CHSP）富含游离的羟基，具有与右旋糖酐类似的化学性质，故本文选用DBTDL 为催化剂，合成FITC-CHSP 材料。 在纳米载药体系的研究中，对纳米粒如何进入细胞这一过程的研究极为重要，但是对于 疏水改性多糖纳米粒进入肿瘤细胞的机制研究却很少。本研究通过FITC 标记CHSP，透析 法制备FITC-CHSP 纳米粒，并进行表征。以HepG2 为模型细胞，采用荧光光度法研究纳米 60 粒浓度、孵育时间以及温度对HepG2 摄取纳米粒的影响以及摄取机制。 1 材料与方法 1.1 材料 FITC（Sigma），Triton X-100（Amresco）， 蔗糖（Amresco），甲基-β-环糊精（Ruibio）， DBTDL（梯希爱上海化成工业发展有限公司），氯丙嗪及阿米洛利（Sigma），人肝癌细胞 65 HepG2（ATCC），DMEM 培养基（HyClone），胎牛血清（HyClone），胰蛋白酶/EDTA 消化液（GIBCO），青链霉素霉素混合液（北京索莱宝生物科技有限公司），叠氮化钠及 Micro BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所），透析袋（Mw 8000-12000，美国）， 其余药品、试剂均为分析纯。 CO2 恒温培养箱（日本SANYO），超净工作台（苏州净化设备有限公司），倒置显微 70 镜（德国Leica），全波长扫描多功能酶标仪（美国Thermo Fisher），电子天平（瑞士Mettler Toledo），透射电镜（JEM-100CXⅡ，日本），核磁共振仪（VARINA INOVA 500MHz， 美国），傅立叶变换红外光谱仪（FTS 3000，BIO-RAD，美国），动态激光粒度分析仪（BI-90US， 日本）。 1.2 方法 75 1.2.1 FITC-CHSP 的制备及表征 FITC-CHSP 制备方法[9,10]：25 mL 圆底烧瓶中加入100 mg CHSP 和3 mL 的二甲基亚砜 溶剂，搅拌条件下溶解为澄清的溶液；称取10 mg FITC，加到CHSP 溶液中。待FITC 完全 溶解，分别向反应液移取400 μL 吡啶和30 μL DBTDL，100℃油浴搅拌下，控温反应4 h， 得黄褐色反应液，停止反应。待反应液冷至室温，将反应液滴入100 mL 无水乙醇，得黄色 80 絮状固体。无水乙醇浸泡洗涤2 次，每次50 mL，20 mL 丙酮洗涤1 次。过滤收集黄色絮状 固体，40℃真空干燥过夜。产物通过FT-IR 和1HNMR 表征。FITC 的取代度通过1HNMR 计算，计算公式如下： DS%=(Aδ10.16/[4(Aδ4.60+ Aδ5.05)]×100% 1.2.2 FITC-CHSP 自聚集纳米粒的制备及表征 采用透析法制备FITC-CHSP 85 纳米粒：将0.1 g FITC-CHSP 溶于10 mL DMSO，将溶液 转入透析袋中，置于1 L 蒸馏水中透析24 h，在一定的间隔时间分别替换新鲜蒸馏水。24 h 后，用探头超声仪超声功率为50 W 超声2 min，采用脉冲超声方式重复两次。经0.45 μm 微 孔滤膜过滤即得自聚集纳米粒混悬液。采用透射电镜观察纳米粒形态，采用粒度分析仪测定 纳米粒粒径及分布。 90 1.2.3 体外细胞摄取实验 HepG2 细胞在含10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素、100 U/mL 青霉素的DMEM 高糖 培养基中，于37℃、含5% CO2 孵育箱中培养。 将呈指数生长期的HepG2 单层培养细胞用0.25%胰酶/EDTA 消化后，调细胞密度为 5×104/mL 接种于24 孔板中，每孔接种1 mL，置37℃，5% CO2 培养箱，待细胞充分贴壁融 95 合率达80%时，吸弃培养基，分别加入1 mL 不同浓度FITC-CHSP 纳米粒悬液，或者改变 孵育温度（37℃或4℃），或者孵育不同时间。吸弃孵育液后用冰冷的PBS 液（4℃，pH7.2） 洗3 次，用1 mL 含有0.5% TritonX-100 的0.2N NaOH 溶液裂解细胞，一部分裂解液用来测 定荧光强度（激发波长488 nm，发射波长520 nm）。另一部分裂解液用Micro BCA 蛋白定 量试剂盒测定细胞内的总蛋白。 100 将未经纳米粒悬液孵育的HepG2 细胞用冰冷的PBS 液洗3 次，用1 mL 含有0.5% TritonX-100 的0.2N NaOH 溶液裂解细胞，用裂解液制备一系列浓度梯度的FITC-CHSP 纳 米粒悬液，以FITC-CHSP 纳米粒的浓度为横坐标、对应的荧光强度为纵坐标，建立标准曲 线。HepG2 细胞对纳米粒的摄取程度用单位质量（mg）的细胞内总蛋白中含有的FITC-CHSP 纳米粒的质量（μg）来表示。 105 将0.15 mg/mL FITC-CHSP 纳米粒悬液以每孔1 mL 加入已培养HepG2 的24 孔板中， 37℃分别孵育0.5、1、1.5、2、3、4h。按上述方法测定HepG2 细胞对纳米粒的摄取量。 将不同浓度的FITC-CHSP 纳米粒悬液（0.05、0.15、0.3、0.5、1.0、2.0 mg/mL）以每 孔1 mL 加入已培养HepG2 的24 孔板中，37℃孵育2 h。按上述方法测定HepG2 细胞对纳 米粒的摄取量。 110 将0.05、0.15 及0.25 mg/mL FITC-CHSP 纳米粒悬液分别以每孔1 mL 加入已培养HepG2 的24 孔板中，分别于37℃和4℃孵育2 h。按上述方法测定HepG2 细胞对纳米粒的摄取量。 1.2.4 内吞抑制实验 将呈指数生长期的HepG2 单层培养细胞用0.25%胰酶/EDTA 消化后，调细胞密度为5 ×104/mL 接种于24 孔板中，每孔接种1 mL，置37℃，5% CO2 培养箱，待细胞充分贴壁融 115 合率达80%时，吸弃培养基，分别加入1 mL 10 μg/mL 氯丙嗪（网格蛋白介导的内吞途径 的特异性抑制剂），10 mM 甲基-β-环糊精（小窝蛋白介导的内吞途径的抑制剂），50 μM 阿 米洛利（巨胞饮抑制剂），37℃孵育30 min，除去孵育液后用PBS 洗三次，加入1 mL 0.15 mg/mL FITC-CHSP 纳米粒悬液，37℃孵育2 h。除去孵育液后用PBS 洗三次，用1 mL 含有 0.5% TritonX-100 的0.2N NaOH 溶液裂解细胞，按照1.2.3 所述方法测定HepG2 细胞对纳米 120 粒的摄取程度（μg/mg 细胞总蛋白）。对照组为不经各种抑制剂预处理，直接加入FITC-CHSP 纳米粒悬液，37℃孵育2 h。 2 结果与讨论 2.1 FITC-CHSP 的表征 2.1.1 FITC-CHSP 的红外谱图 125 图1 红外谱图 (a) FITC (b) CHSP (c) FITC-CHSP Fig.1. IR spectrum of (a) FITC, (b) CHSP, and (c) FITC-CHSP FITC 的红外光谱图(见图1，a)显示，在3423 cm-1 处有较宽而强的羟基特征吸收峰；2015 130 cm-1 处有一个很强的峰，是异硫氰酸基团的特征吸收峰；1727 cm-1 的强峰属于内酯环上的 羰基吸收峰；1594、1535 和1458 cm-1 的吸收峰是由苯环骨架伸缩振动产生的。与FITC 相 比，FITC-CHSP(见图1，c)在3485 cm-1 附近有羟基的振动吸收峰；2930 cm-1 处是-CH3，-CH2- 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写MBA论文 代写博士论文 代写医学论文 |
