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改良鸡胚尿囊膜肿瘤实验动物模型及其生 物学行为观察 马继伟1，张勇1，张逸铠1，马征来2，闫雍容1，杜展1，王超1，夏潮涌2， 5 钟雪云1** 作者简介：马继伟，(1990-)，男，在读硕士，肿瘤病理。 通信联系人：钟雪云，(1955-)，女，教授，肿瘤病理。E-mail: tzxy@jnu.edu.cn （1. 暨南大学医学院病理教研室，广州 510632； 2. 暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室，广州 510632） 摘要：目的：利用鸡胚尿囊膜建立人移植瘤模型并观察其生物学行为和组织学形态已有报道。 但是，在实际工作的过程中仍存在不少问题。因此，有必要通过改良的方法，获得简单，快 10 捷，可重复的动物模型。方法：将人胶质瘤SWO-38 细胞接种至鸡胚尿囊膜表面，观察影响 鸡胚的存活和成瘤的可能因素、移植瘤的生长特性和形态学特征。结果：利用改良的方法成 功建立胶质瘤鸡胚尿囊膜的模型；肿瘤组织能够诱导血管生成，镜下形态符合恶性胶质瘤的 形态学特征。结论：该模型简单，快捷，易于建立。便于观察肿瘤组织的生物学行为，可用 于抗肿瘤的药物筛选。 15 关键词：胶质瘤；鸡胚尿囊膜；移植瘤；血管生成 中图分类号：R739.4 Improvement and biological behavior observation of human xenograft model on chick embryo chorioallantoic membrane 20 MA Jiwei1, ZHANG Yong1, ZHANG Yikai1, MA Zhenglai2, YAN Yongrong1, DU Zhan1, WANG Chao1, XIA Chaoyong2, ZHONG Xueyun1 (1. Department of pathology, medical school, Jinan University, GuangZhou 510632; 2. Department of histology and embryology, medical school, Jinan University, GuangZhou 510632) 25 Abstract: Objective : Establising human xenograft model on the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) and observing its biological behavior have been reported , however ,problems remain , In order to obtain a model which is easy to be duplicated, improving some technique is necessary. Methods : Human glioma cell line SWO-38 was inoculated on the chick embryo chorioallantoic membrane to observe the factors affecting the survival of the transplanted human 30 glioma cells, growth characteristics of the transplanting tumor and the morphological feature. Result : Human glioma model was successfully established using the modified method it shows angiogenesis effects and morphological characteristics of glioma cells. Conclusions：This model can be easily duplicated, used in biological behavior observation and the research of selection for antineoplastic drugs. 35 Keywords: Glioma; Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM); Xenograft model; Angionesis 0 引言 动物模型是研究疾病发生发展及相关机制的重要手段，目前常用的体内实验模型为裸 40 鼠，而裸鼠模型因其实验周期长，费用昂贵、实验条件要求高，限制了它的广泛应用。近年 来,鸡胚尿囊膜（chick choriollantoic membrane,CAM）模型在肿瘤血管方面的研究受到关注。 因鸡胚发育的9-14 天，免疫系统并没有完全形成,排斥反应尚未建立, 有利于建立各种移植 肿瘤模型。相比裸鼠等哺乳动物模型,利用鸡胚CAM 建立肿瘤模型, 建模周期短,便于观察。 肿瘤细胞种植到CAM 相对无血管的区域后3-5 天，肉眼可见肿瘤形成，且生长迅速。国内 45 外已有学者利用鸡胚尿囊膜成功建立了前列腺癌[1]、卵巢癌[2]、肾癌[3]及U87 细胞胶质瘤[4] 等移植瘤模型。本研究利用改良的实验技术建立恶性胶质瘤鸡胚尿囊膜(CAM)移植肿瘤模 型，为后续开展恶性胶质瘤的生物学行为、肿瘤与血管形成关系、抗肿瘤药物筛选等研究提 供良好的动物实验模型。 1 材料与方法 50 1.1 材料 SWO-38 胶质瘤细胞株为本教研室自行建系[5]；受精种蛋：（华农正大禽业有限公司）； 改良型RPMI－1640 培养基(Hyclone 公司)；胎牛血清(天津灏阳公司)；胰蛋白酶(Difco 公司)； 甲醛(国产分析纯试剂)；OLYMPUS 体式显微镜（日本奥林巴斯公司）。 1.2 方法 55 1.2.1 细胞培养 细胞培养SWO－38 细胞于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。培养基为改良型RPMI －1640 培养液(加入10%胎牛血清、1×105 U/L 青霉素、100mg/L 链霉素)。取处于对数生长 期细胞用于实验。 1.2.2 鸡胚孵育 60 德国伊沙鸡种，购自华南农业大学正大禽业有限公司，受精种蛋经消毒放入于温度37.0 ℃，相对湿度60%—80%的恒温孵箱中孵育，胚头斜向上方，鸡蛋长轴与蛋托约成45°，每 天晾蛋及翻蛋10 分钟，孵育备用。 1.2.3 细胞接种 取对数生长期的SWO-38 细胞，常规0.25%胰酶消化4 min，1000 r/min 离心3 min,用无 65 血清培养基调整细胞数量并分为0.8×106/60 μL,1×106/60μL,2×106/60 μL,4×106/60μL,8×106/60μL 和不含细胞的无血清培养基组(对照组)。种蛋46 支，共分为6 组， 参考贺国安等[6]的无气室孵育法（有改进）。孵育9 天后[7]在照蛋器下用铅笔划定气室的范 围，75%酒精常规消毒，无菌镊子在划定气室范围内先轻轻敲开蛋壳大小约5×5 mm 保留壳 膜，用浸湿的PBS 棉球轻沾壳膜以吸走蛋壳碎屑，继续开口至1.5×1.5 cm 大小，无菌镊子 70 撕去周围蛋壳和壳膜，沾有无菌PBS 溶液的棉球轻轻湿润气室膜，此时可清楚显现尿囊膜 的血管，尖镊子轻轻划开气室膜，切勿损伤其下尿囊膜，揭开气室膜暴露其下尿囊膜，于大 血管之间相对无血管区放置一内径为4 mm 的硅胶圈，按照分组每支鸡胚滴加不同密度的细 胞或不含细胞的无血清培养基60 μL，用无菌透明胶封闭，接种24 小时后取出硅胶圈，同 时覆盖2×2 cm 的无菌保鲜膜于开口位置，继续用无菌透明胶封闭。每隔24 小时在灯下通过 75 窗口观察鸡胚存活及接种区尿囊膜肿瘤及周围血管情况。 1.2.4 移植瘤取材 鸡胚接种后继续孵育5 天，于水下剥离蛋壳和壳膜，完整取下鸡胚，置于盛有10%甲 醛固定液的皿中，肿瘤取出常规石蜡包埋，HE 染色进行形态学观察。 1.2.5 统计学处理 80 本文分类资料采用率表示，多组数据之间率的比较采用X2 检验，P<0.05 为差异有统计 学意义。 2 结果 2.1 接种细胞数量对存活率及成瘤率的影响 表1 不同细胞数目对鸡胚存活率和成瘤率的影响 Tab.1 Effect of the number of inoculated glioma cell on the survival rate of chicken 85 embryos and tumor formation rate 组别 实验鸡胚数 存活率（%） 成瘤率（%） 对照组 5 60 0 0.8×106 5 100 0 1×106 7 57 50 2×106 10 70 57.1 4×106 11 72 62.5 8×106 8 87 71.4* 注：* 与对照组和0.8×106 组相比P< 0.05 Note: *P<0.05 vs control group and 0.8×106 group 本实验将SWO-38 细胞按细胞数分成5 组分别接种至鸡胚尿囊膜，继续孵育5 天观察， 90 结果显示各组SWO-38 细胞对鸡胚存活率并无影响，1×106 细胞数量组存活率略低，经统计 学分析不同细胞数量对鸡胚存活率的影响差别无统计学意义（p>0.05）。如表所示成瘤率随 细胞数目的增加而升高，8×106 细胞数量组的成瘤率与对照组及0.8×106 组比较差异有统计 学意义（p<0.05） 2.2 移植瘤诱导血管生成 95 实验中观察到，肿瘤细胞接种24 小时内肿瘤细胞悬液呈薄膜样浮于尿囊膜上，血管无 特殊改变；48 小时内肿瘤肉眼可见，并可观察到较为微弱的血管反应；72 小时肿瘤小团块 形成并牵拉尿囊膜使尿囊膜包裹肿瘤团块，血管增粗紊乱；至接种后第5 天，肿瘤质韧、呈 鱼肉状，外有尿囊膜包裹，肿瘤诱导血管围绕肿瘤生长。 100 图1 移植瘤生长规律 Fig.1 Growth characteristics of the transplanting tumor 2.3 移植瘤的形态学特征 常规石蜡包埋，HE 染色，镜下见模型瘤体以鸡胚尿囊膜为基质生长，2×106/60 μL 细胞 105 密度肿瘤组织生长较8×106/60 μL 细胞密度生长较好（图2 A B）。局部区域可见肿瘤细胞 迁移至血管周围（图2 D )，新生血管围绕肿瘤团块生长（图2 C），血供丰富处肿瘤团块较 大，反之肿瘤细胞分布稀疏。肿瘤细胞较密集的地方还可以观察到肿瘤中心因血供不足而发 生坏死，肿瘤细胞周围存在炎症反应（图2 E）。肿瘤细胞多呈圆形或椭圆形，体积大，可 见瘤巨细胞，胞浆少，核大深染，异型性明显，病理性核分裂相常见（图2 F）。上述表现 110 均符合恶性肿瘤的组织学特征。 图2 人胶质瘤SWO-38 鸡胚移植瘤组织形态 Fig.2 The morphology of human glioma cell line SWO-38 in chicken chorioallantoic membrane 图A 2×106 细胞密度肿瘤组织 图B 8×106 细胞密度肿瘤组织 图C 肿瘤组织血管供应 图 D 肿瘤细胞侵袭 115 血管 图E 肿瘤组织周围炎症反应 图F 肿瘤细胞核分裂像 3 讨论 已有学者利用鸡胚尿囊膜模型成功建立宫颈癌[8]、骨肉瘤[9]等移植瘤模型，但均未对其 技术细节进行探讨，本实验着重对实验技术进行改良及探讨。常见的开窗法是在孵育第7-9 120 天的蛋壳上磨切开窗, 将样品植人后再封闭切口继续孵育，但是在磨切蛋壳时会将蛋壳碎屑 遗留至壳膜中，增加污染机会，同时在操作中易损伤尿囊膜血管影响蛋胚存活。本文采用无 气室开窗法，减少了蛋壳碎屑残留，同时尿囊膜可充分暴露，便于确定加样位置。有文献报 道利用透明胶封闭后每天通过透明胶观察鸡胚存活及成瘤情况[10]，但是在实践过程中发现， 直接用透明胶封闭24 小时后，透明胶产生白雾，无法观察鸡胚内部情况。故本实验尝试先 125 用无菌保鲜膜封闭窗口再以透明胶固定的方法，既避免白雾的产生，又利于直观观察鸡胚情 况。以无气室开窗法结合无菌保鲜膜封闭窗口，保证了鸡胚存活率的稳定，同时利于后续实 验观察。尿囊膜的药物及移植瘤实验中，常用载体为滤纸、甲基纤维素、明胶海绵或者直接 滴加，本实验采用内径为4 mm 的硅胶圈放置于大血管间的相对无血管区，利于肿瘤细胞悬 液聚集在一定范围内不致弥散。预实验曾尝试过内径8 mm 硅胶圈，其与尿囊膜接触面积较 130 大，对血管压迫作用较明显，故最终选择4 mm 胶圈，胶圈虽然可以很好的聚集肿瘤细胞但 是因其对血管有损伤故于接种后24 小时取出胶圈，也有报道[11]胶圈不取出可观察肿瘤细胞 在胶圈内生长，预实验中采用此种方法未获成功。 本研究重点观察了不同细胞数目对鸡胚存活、成瘤的影响及肿瘤组织与血管生成的关 系。研究发现:不同细胞数目对鸡胚存活率无影响，且随着接种细胞数目的增加鸡胚成瘤率 也在增加，135 但是实验中观察到细胞密度2×106/60 μL 组较之细胞密度8×106/60 μL 组肿瘤生 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写论文 代写MBA论文 代写博士论文 |
