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高于等于12%摩尔比，脂质体膜在较低电场强度下便能发生电通透。在本文中，所用的卵 145 磷脂与胆固醇的质量比为6：1，这样制得的脂质体膜的稳定性和通透性均能满足实验要求。 3.2 脂质体的排队研究 将配制好的脂质体悬浮液注入电融合芯片中，然后在相对的电极上施加频率为300 KHz 的正弦信号（图5A），观察排队效果。实验中，正弦信号的伏值（峰峰值，Vpp）从1 V 到5 V 变化。当Vpp 达到2 V 时，脂质体开始在介电电泳力的作用下发生运动。当Vpp 达 150 到3 V 时，大部分脂质体移动到电极附近，相互靠在一起排列，发生排队现象（图6）。与 相同芯片上的细胞排对比较，脂质体排队所需信号强度略低一些。一方面是由于脂质体的尺 寸较大，所受介电电泳力也大；另一方面是脂质体的重量要小于相同尺寸的细胞，所需要的 驱动力也小。 图5 脂质155 体融合所施加的电信号。（A）排队信号，（B）穿孔信号，（C）融合信号 Fig.5 Electric signals for liposome fusion. (A) alignment, (B) electroporation, (C) fusion 根据仿真分析[14,18,19]，在交错微电极阵列芯片中，当在相对电极上施加一定的电压信号 时，在微电极的直角突出部分向对侧电极最近点的方向有较强的电场存在。同样，该方向的 160 电场梯度也是最大。根据介电电泳力产生的原理[20,21]，芯片中的脂质体应该沿着相对电极尖 角间连线成串排列，就如细胞电融合实验研究中的细胞排队[14]。然而，由于脂质体内不像 细胞那样有细胞骨架和细胞器的存在，质量极轻而极易变形。因此，尽管脂质体在介电电泳 力作用下可以移动到电场梯度最高的地方排列，但是环境中的其它力，如液体流动、实验台 不平和振动产生的细微作用都可以使脂质体受力变形，而脂质体之间的相互挤压作用也可以 165 使其有一定形变。因此，脂质体的排列位置虽然大体落在高电场区，但不一定能够处于电场 最强的区域（图6），这对后面的融合有一定的影响。 图6 脂质体排队过程。（A）排队前，（B）排队后 Fig.6 Alignment of liposomes. (A) before and after (B) the alignment 170 我们将固定视野里施加排队电信号后两两排队脂质体的数量与该视野里脂质体总数量 之比称为脂质体的排队率，实验中脂质体排队率约为40 ∼ 50%。如果视野里脂质体数量与 电极数量合适，会有利于增加排队率。多种因素都可能对排队率产生影响。首先，如果脂质 体数量太高，大量脂质体在介电电泳力的作用下被电极吸附而形成脂质体堆，不利于融合的 175 发生且影响融合过程的观察，脂质体数量过少则会减少脂质体两两排队的数量。另外，脂质 体悬浮液中的杂质也会影响排队的效果。 3.3 脂质体的融合研究 当脂质体排队完成后，将排队信号切换为电穿孔信号——一系列脉冲信号（图5B）。 信号幅值（Vpp）为60 V，脉宽为50 μs，脉冲间隔为200 ms，脉冲个数为6 个。在穿孔信 180 号后紧接着施加一组衰减的正弦信号（图5C），该信号可以维持脂质体对的紧密贴合，利 于融合的发生。 图7 芯片上的脂质体融合。（A）排队，（B）穿孔，（C）融合 Fig.7 On-chip liposome fusion. (A) alignment, (B) electroporation, (C) fusion 185 在融合实验中，部分脂质体在施加脉冲电压后发生穿孔并迅速融合，不同脂质体对的融 合条件有一些差异。如图7 所示，在相邻的两个电极上有3 对脂质体两两排队，当施加第一 组脉冲后，第1 对和第3 对脂质体发生融合，施加第二组脉冲后，第2 对脂质体融合。实验 中还发现，有少量脂质体对在脉冲作用下相互挤压变形，并有弹跳现象，未发生融合。实验 190 结果表明，在电极上排队的大小相近的脂质体对更容易发生融合，而尺寸相差太大的脂质体 则不易发生融合，这可能是由于不同尺寸脂质体的穿孔电压差别较大所引起的。除了尺寸上 的差异，脂质体制备过程中的其它因素也可能会影响脂质体融合。例如，当脂质体层数达到 2 层或以上时，由于膜穿孔后会在很短的时间内闭合，而脂质体的内层磷脂会不利于脂质体 膜变形，阻碍融合的发生；制备或离心过程中产生的磷脂碎片等杂质若位于两个排队的脂质 195 体接触点，将阻碍脂质体穿孔后的融合；制备脂质体时加入适量的胆固醇将有助于脂质体膜 流动性和稳定性增强不易在离心时破碎，但过量的胆固醇可能会使得脂质体柔韧性过高而不 利于穿孔的发生。加入另外的试剂也可能会促使脂质体排队后结合得更加紧密或者在接触点 形成位阻从而影响脂质体穿孔后的融合。 我们将固定视野里排队脂质体中发生融合的对数与该视野中排队脂质体对数之比称为 200 融合率。尺寸较均匀的两两排队脂质体在适当的缓冲液中，当电场强度为9 kV/cm 的电脉冲 下，其融合率能达到20 %左右。在相似的情况下，脂质体融合率比细胞融合率要低很多， 其中的最主要的原因是脂质体大小不均一，不同尺寸的脂质体所需的穿孔电压各不相同[8]。 如果排队的两个脂质体尺寸差别较大，二者的融合就比较困难。因此，要提高融合率，就需 要在脂质体制备过程中提高脂质体的均一性。另外，脂质体中缺乏骨架和蛋白质等结构，柔 205 性很好，相对来说穿孔比较困难，穿孔后的膜重建可能也比细胞困难，这也是融合率不高的 一个原因。 4 结论与展望 本文利用基于硅玻基底的微电极阵列电融合芯片进行了脂质体融合的研究。研究结果表 明，脂质体制备过程中合适的胆固醇浓度对融合实验的顺利开展有重要意义。在芯片上，由 210 于微电极对间距小，所需排队和融合电压也较低。高密度电极阵列的使用大大提高了一次可 操作细胞的数目，适度的微通道深宽比使脂质体排队和观察都更加容易。这些都表明，基于 微电极阵列芯片的脂质体融合方法在基础和应用研究中将更具效率。但是，在现有研究中， 脂质体的融合率大大低于细胞融合的融合率，还有很多方面有待改进。例如，目前采用的脂 质体制备方法中，脂质体粒径分布较宽，使得部分脂质体过大或过小，影响排队和融合效果， 215 需要探索更好的脂质体制备方法。另外，脂质体重量极轻，柔韧性好，需要在脂质体制备材 料和脂质体内容物方面进行优化研究，提高其穿孔能力。 学术论文网Tag：代写硕士论文 代写论文 代写毕业论文 代写毕业设计 |
