基于微电极阵列芯片的脂质体电融合研究#
蒋凤1，杨军1，王振宇1，胡宁1，廖彦剑1，郑小林1，谢琳2，杨忠3，陈洁4**
基金项目：国家自然科学基金（Nos. 81071278，30870661）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”（No.
NCET-09-0842）；重庆市科技计划（Nos. CSTC2010AC5029，CSTC2009AB5081，CSTC2009BB5180）；
教育部高等学校博士学科点科研基金（Nos.200806110019）；重庆大学研究生创新团队建设（No.
200909A1002）资助项目
作者简介：蒋凤，(1987-)，女，硕士研究生，主要研究脂质体制备与电融合技术。
通信联系人：杨军，(1974-)，男，副教授，主要研究方向为生物传感器，微流控生物芯片. E-mail:
bioyangjun@cqu.edu.cn
（1. 重庆大学生物工程学院，生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆 400030；
5 2. 第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科，重庆 400042；
3. 第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室，重庆 400038；
4. 重庆医科大学附属儿童医院儿童营养研究中心，重庆 400014）
摘要：利用旋转蒸发法制作基于大豆卵磷脂的一种大型脂质体，在微电极阵列电融合芯片上
进行脂质体融合实验研究。在电融合过程中，首先利用介电电泳力实现脂质体在微流控芯片
10 中的排队，然后利用高场强的电脉冲使脂质体膜发生可逆电穿孔，在持续的介电电泳力的作
用下使穿孔的脂质体实现融合。实验结果表明，微电极阵列电融合芯片不但可以实现细胞的
配对和融合，也可以用于脂质体的配对与融合。微电极阵列结构可以同时操作大量脂质体并
实现排队及融合，而玻璃基底材料和低深宽比的通道深度更有利于脂质体融合过程的观察与
控制。
15 关键词：微流控；脂质体；介电电泳；电融合；微电极
 40 0 引言
脂质体是一种人工双层的脂质小囊，外部为脂双层薄膜，内部为包裹的液体成分。自从
1965 年被发现以来，脂质体在医药、生物化学研究和美容产品研制等领域被广泛使用[1-5]。
 脂质体可以以一种类似细胞膜的方式将内外物质分隔开来，通过在内部包裹特定物质来实现
载体功能，还可以通过脂质体表面的修饰来实现物质的定向传递。脂质体融合是用人工方法
45 将两个或多个脂质体融合到一起，它是脂质体与细胞融合研究的基础。这些技术在超小仿生
反应器、生物膜的相互作用研究、基因转染、细胞器监测、药物定点传送、细胞膜融合机理
研究以及细胞膜蛋白的生物物理学研究等方面发挥着越来越大的作用[6-9]。与细胞融合类似，
脂质体融合过程中，先需要使脂质体两两之间互相紧密接触，即脂质体在液体环境中的“排
队”，然后再使用不同的诱导方法使相互接触的脂质体融合成一个更大的脂质体。
50 早期的脂质体融合采用钙离子促融法，即在脂质体悬浮液中加入适量钙离子，在适当的
温度下放置一段时间，脂质体可以自动融合成较大脂质体。这种方法主要应用在纳米级脂质
体中，脂质体的相互接触和融合过程均不可控，常常导致多个脂质体聚集融合[10]。此后，
一些可控的融合方法被提出。1999 年，瑞典和美国的科学家利用显微操作固定的碳纤维电
极来控制脂质体，使两个脂质体互相紧密接触，再在脂质体上施加电脉冲实现了脂质体的融
55 合[11]，这开启了早期的脂质体电融合研究。除了电融合，其它物理方法也可被用于脂质体
的融合。例如，2002 年，斯坦福大学的Wilson CF 用光镊和纳米吸管相结合来控制脂质体[12]。
在此基础上，美国国家标准和技术研究院的Kulin S 等人用光镊操作脂质体，再用激光使脂
质体穿孔并融合[13]。这些方法虽然实现了脂质体的可控融合，但是一次仅能操作一对脂质
体，效率很低。而且，光镊操作所用设备精密昂贵，还不适用于稳定性较差的单层大型脂质
60 体。
2004 年，东京大学的Tresset G 等人研制了一种用于脂质体电融合的微流控芯片，并利
用介电电泳原理实现脂质体的排队，然后施加电脉冲实现脂质体的融合[8]。此后，他们又在
芯片的可观察性以及包裹纳米结构和大分子的脂质体融合方面做了进一步研究[9]。这些研究
表明，微电极融合芯片可以更准确地控制脂质体，实现精确的排队和高效的融合。而且，由
65 于芯片上电极间距大大缩小，融合所需电压也大大降低，对电信号发生器的要求也相应降低，
这更有助于该技术的广泛应用。但是，现有的脂质体融合芯片采用高深宽比的电极设计，电
极间的微通道很深，常常达到数百微米，这不利于脂质体融合过程的观察。同时，由于脂质
体质量很小，很容易在液体中悬浮，融合研究中常用的十余微米直径的脂质体将在微通道中
呈多层分布，使脂质体之间难以有效排队和融合。而且，现有芯片中微电极数目不多，一次
70 可同时控制的脂质体也较少，效率较低。
因此，本文在已有的细胞电融合芯片研究[14,15]基础上，设计并制作了一种硅玻基底的微
电极阵列芯片。通过高密度的电极设计来提高脂质体融合的产率，而且，低深宽比的通道设
计和玻璃基底更利于脂质体的融合和观察。
1 微芯片的设计及加工
75 1.1 微电极阵列设计
微电极阵列融合芯片加工在玻璃基底上，整个芯片的尺寸为2.4 cm × 1.2 cm。芯片由交
叉的两个梳状微电极阵列组成，微电极排布于阵列的梳齿上，相邻梳齿上的微电极呈现交错
式结构排列；同时，梳状微电极阵列也是微通道的侧壁[15]。该结构可以保证较高的微电极
集成度，本文中芯片共集成了超过6000 对的微电极。微电极自梳脊向通道中心突出，其宽
80 度为20 μm，长度为20 μm，微通道同侧上微电极的间距为60 μm。微通道宽度为100 μm，
深度为42 μm，微通道两侧相对的微电极对之间沿与微通道垂直方向的间距为60 μm（图1）。
 图1 微电极阵列芯片结构示意图
Fig. 1 Schematic of the microelectrode array electrofusion chip
85
1.2 微电极阵列芯片加工
融合芯片的主要加工工艺流程（图2）为：采用静电热键合技术将硅片和玻璃片粘合在
一起形成硅玻键合基片。键合温度为400 oC，键合电压为600 V。玻璃基片选用Corning 7740
玻璃片，厚度为500 μm，可为微电极阵列提供足够的机械支撑和电绝缘特性。
90
图2 基于硅玻基底的电融合芯片的加工流程
Fig.2 Fabrication process of the microelectrode array chip
硅片选用电导率为7 ~ 9 Ω•m 的低阻硅片，厚度为40 μm。由于低阻硅的电阻值为7 ~ 9
95 Ω•m，较长的梳脊电阻可能带来芯片内部电场分布不均匀问题，因此，采用磁控溅射技术在
低阻硅表面溅射厚度为2 μm 的金膜，提高芯片的电气性能。同时，金材料具有良好的生物
相容性，有助于细胞生物安全性。此外，金材料良好的抗氧化、抗腐蚀能力将改善芯片的可
靠性。为提高金膜与低阻硅之间的粘附力，并提高键合引线时的牢固性，在溅射金以前预先
溅射一层50 nm Cr 层；随后利用KI 溶液腐蚀金属引线层，获得与微电极阵列结构一致的金
100 属引线。利用感应耦合等离子刻蚀低阻硅层，直至底部的玻璃基底，获得所需的微电极阵列
结构。
在获得基于玻璃基底的电融合芯片裸片后，采用金丝键合工艺进行芯片的封装，封装工
艺如下：在PCB 基板上制备有与芯片键合点对应的镀金键合点，以及与微电极阵列区域对
应的光窗，以获得良好的实验观测效果。利用TCR3303 UV 胶将芯片固定于光窗上，选用
105 直径为75 μm 的金丝利用金丝键合工艺在PCB 与芯片的键合点之间形成电气连接，以导入
外界电信号，获得可用于实验的芯片（图3）。
 图3 微电极阵列芯片
Fig.3 Microelectrode array chip
110
2 实验部分
2.1 主要仪器与材料
DMI4000 B 倒置荧光显微镜（Leica，德国），RE-52A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器
厂），SHB-III循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司），Centrifuge 5417R 离心机（Eppendorf，
115 德国），细胞型1820A 摩尔超纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司），EE1410 合成函数
信号发生器（南京新联电讯仪器有限公司），自制电融合仪，自制细胞电融合芯片。
大豆卵磷脂（成都市科龙化工试剂厂），胆固醇（分析纯，广州市金渡化工仪器有限公
司进口分装）,氯仿、乙醚、氯化钠、氢氧化钠、无水氯化钙（分析纯，重庆川东化工有限
公司化学试剂厂），磷酸二氢钾（分析纯，重庆博艺化学试剂有限公司）。
120 2.2 融合缓冲液的配制
电融合缓冲（PM）液为含有0.01 mmol/L Ca2+和0.02 mmol/L Mg2+的等渗山梨醇溶液，
其配制方法为：称取5.463 g 山梨醇溶于100 mL 三蒸水；称取1.11 g CaCl2 和4.06 g
MgCl2•6H2O 溶于500 mL 三蒸水，取其中的50 μL 加入山梨醇溶液中，便配制出所需的电
融合缓冲液。
125 3 结果与讨论
3.1 脂质体的制备研究
脂质体的制备方法有多种，可以制备不同特性的脂质体[1,12,16]。本文选用一种较为简单
的方法来制备容易观察融合过程的大型脂质体[12]：首先，称取一定比例的卵磷脂和胆固醇
置于200 mL 圆底烧瓶中，加入适量乙醚直至卵磷脂和胆固醇完全溶解，再倒入与乙醚量相
130 当的生理盐水（生理盐水提前预热至40 oC）；然后在40 oC 水浴下用旋转蒸发仪除去乙醚，
即得到乳白色的脂质体悬浮液，4 oC 保存。这种方法制得的脂质体多为大型脂质体（图4A），
粒径主要在十到几十微米之间（图4B）。
 图4 脂质体制备结果。（A）显微照片，（B）脂质体尺寸分布
Fig.4 Preparation of liposomes. (A) microscopic image, (B) size distribution o 135 f liposomes
在融合实验前，需要对脂质体进行预处理：在20 oC 下用2500 rpm 的速度对脂质体进
行两次离心，将脂质体转移到PM 液环境中，制备成实验用脂质体悬浮液。
在最初选用的脂质体制备方法中，脂质体的制备材料只选用卵磷脂而未加入胆固醇，同
140 样也可以制得脂质体。这种脂质体的尺寸和产率与添加胆固醇时基本无区别。但是，在离心
处理时发现，这种不含胆固醇的脂质体几乎全部破碎。因此，在磷脂中加入胆固醇是必不可
少的，有助于提高脂质体的韧性。而且，研究表明，胆固醇还影响脂质体膜的通透性[17]。
当脂质膜是凝胶态时，如果胆固醇浓度低于6%摩尔比，将不利于电通透；如果胆固醇浓度
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