人早孕期蜕膜腺上皮细胞分离、培养与鉴定
周雯慧，刘永巧，任亮，张元珍**
基金项目：教育部博士点新教师基金（200804861050）；湖北省自然科学基金创新群体项目（2008CDA008）
作者简介：周雯慧，（1978-)，女，副主任医师，副教授，主要研究方向为生殖医学和肿瘤免疫。
通信联系人：张元珍，（1959-），女，主任医师，教授，主要研究方向为生殖医学、产前诊断及优生优育.
E-mail: zhangyuanzhen@vip.sina.com
5 （武汉大学中南医院生殖医学中心，武汉 430071）
摘要：目的：建立一种经济、高效的人早孕期蜕膜腺上皮细胞分离、培养方法。方法：胶原
酶消化蜕膜组织，网筛过滤及差速贴壁法纯化细胞；免疫细胞化学法检测细胞纯度；MTT 增
殖实验分析细胞体外增殖活力。结果：利用此法可成功体外培养人早孕期蜕膜腺上皮细胞，
细胞纯度可达90%以上。结论：此法经济、高效，可获得纯度较高的蜕膜腺上皮细胞。
10 关键词：蜕膜腺上皮细胞；体外培养；细胞鉴定
 0 引言
母胎界面是母体组织与胎儿成分直接接触的界面，妊娠过程中，其局部形成特殊的免疫
微环境，使携带一半父系抗原的胎儿不被母体免疫系统排斥，维持妊娠直至足月分娩。蜕膜
30 腺上皮细胞来源于妊娠期子宫蜕膜，是母胎界面的主要功能细胞。它不仅为胚胎发育提供营
养，还能通过合成分泌多种细胞因子调节子宫局部免疫微环境[1、2]。然而长期以来，由于母
胎界面细胞组成复杂，分离和原代培养较为困难，有关蜕膜腺上皮细胞的生物学功能还有许
多未解之谜。本研究拟建立一种合适的分离、培养方法，获得充足、纯化的人早孕期蜕膜腺
上皮细胞，从而为研究母胎免疫调节机理奠定实验基础。
35 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 蜕膜组织
经武汉大学中南医院伦理委员会批准及患者本人知情同意，于妇产科门诊手术室收集
 10 例正常妊娠6~10 周蜕膜组织，置于1640 培养液中2 小时内送至实验室。
40 1.1.2 试剂
胎牛血清、DMEM 及1640 培养液（Gibco 公司）；胶原酶Ⅳ（Invitrogen 公司）；ECM
胶（Sigma 公司）；鼠抗人角蛋白7 单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司）；鼠抗
人波形蛋白单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组化试剂盒（福州迈新生
物技术开发有限公司）。
45 1.1.3 主要设备
二氧化碳培养箱；倒置相差显微镜；超净工作台；恒温水浴箱。
1.2 方法
1.2.1 蜕膜腺上皮细胞的分离培养
蜕膜组织去除血污后分装入小瓶剪碎至糊状（约1 ㎜ 3），加入10 倍体积0.1%胶原酶
50 IV，置37℃恒温水浴消化1 小时收集上清，消化液经100 目、300 目网筛过滤后，反冲300
目网筛2~3 次，反冲液1500 rpm离心10 分钟，将细胞团重悬于2 ml 含15%胎牛血清的DMEM
中，接种于培养皿，4 小时后将未贴壁的细胞悬液转移至已铺置ECM 胶的培养皿。贴壁24
小时后换液，每2 天换液一次。
1.2.2 细胞来源及纯度鉴定
55 ①制备细胞爬片：将蜕膜腺上皮细胞接种于无菌盖玻片培养48 小时后取出玻片，PBS
洗涤后4%多聚甲醛固定待用。②采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连结法（SP
法），以角蛋白7（CK7）单克隆抗体、波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体鉴定细胞。
1.2.3 MTT 增殖实验
分离得到的蜕膜腺上皮细胞以2×104 细胞/孔种植于96 孔板，培养24、48 及72 小时后，
60 每孔加入MTT（5mg/ml）20 μl，37℃继续孵育4 小时后终止培养，每孔加入150 μl DMSO，
室温振荡10 min，使结晶充分溶解。选择492 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光
度值。
2 结果
2.1 体外培养人早孕期蜕膜腺上皮细胞的特征
65 蜕膜腺上皮细胞接种24 小时可基本贴壁，细胞形态似蝌蚪状，呈旋涡状排列，生长速
度较蜕膜基质细胞慢，约6~7 天长满（图1）。
 图1 人早孕期蜕膜腺上皮细胞形态特征
Fig 1 Morphology of human first-trimester decidual epithelial cells
70 倒置相差显微镜下观察蜕膜腺上皮细胞形态特征 （100×）
2.2 免疫细胞化学鉴定蜕膜腺上皮细胞纯度
蜕膜腺上皮细胞与蜕膜基质细胞相反，角蛋白7 染色阳性，波形蛋白染色阴性（图2）。
通过波形蛋白和角蛋白染色鉴定细胞纯度可达90%以上。
75
图 2 人早孕期蜕膜腺上皮细胞免疫细胞化学鉴定
Fig 2 Characterization of human first-trimester decidual epithelial cells by immunocytochemistry
A：腺上皮细胞CK7 染色，B：腺上皮细胞vimentin 染色，C：腺上皮细胞同型对照（200×）
80 2.3 蜕膜腺上皮细胞体外增殖活力
利用MTT 增殖实验检测原代培养的蜕膜腺上皮细胞体外增殖活力，发现腺上皮细胞生
长速度虽稍慢，但是随着培养时间延长其增殖活力明显升高，培养72 小时后细胞增殖能力
为24 小时的2.4 倍。（图3）。
85 图3 人早孕期蜕膜腺上皮细胞体外增殖活力
Fig 3 Proliferative viability of human first-trimester decidual epithelial cells
 3 讨论
3.1 腺上皮细胞是母胎界面的主要组成细胞
正常妊娠时，子宫内膜在卵巢甾体激素的作用下形成蜕膜，与胎儿来源的滋养层共同构
90 成母胎界面。蜕膜组织的细胞成分相当复杂，根据其来源，可将蜕膜细胞大致分为三类，包
括子宫内膜源性细胞、免疫活性细胞及侵蚀至蜕膜的滋养细胞，蜕膜腺上皮细胞是子宫内膜
源性细胞的主要成员，在胚胎植入过程中扮演重要角色[3、4、5] 。
3.2 本实验方法的独特之处
3.2.1 胶原酶消化
95 胰酶对上皮组织的作用较强，而胶原酶对细胞间质有较好的消化作用，对上皮细胞影响
不大，因此本研究首先利用胶原酶消化蜕膜组织，使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害，
从而分离出上皮细胞。
3.2.2 网筛分离及差速贴壁法相结合
蜕膜基质细胞体积小，蜕膜腺上皮细胞体积较大[6]，后者多数不能通过300 目网筛，可
100 利用网筛过滤法将二者初步分离。蜕膜组织细胞成分复杂，滤过液中还含有蜕膜免疫细胞、
成纤维细胞及红细胞等多种细胞，蜕膜腺上皮细胞贴壁时间较长，约24 小时方可基本贴壁。
本研究在接种腺上皮细胞4 小时后将其转种到新的培养皿，可进一步去除基质细胞，从而提
高了细胞纯度，并避免基质细胞生长过快影响腺上皮细胞的生长状态。MTT 增殖实验也发
现延长贴壁时间不仅不影响其纯度，还能通过细胞间相互作用，促进细胞贴壁，加快细胞生
105 长，使细胞保持良好的生长状态。
3.2.3 ECM 胶的使用
ECM 胶主要由层粘连蛋白、 IV型胶原、蛋白聚糖以及巢蛋白等构成，能诱导细胞特性
表达，对细胞贴附、分化、生长和增殖等都起到重要作用。由于腺上皮比较娇嫩，体外培养
相对困难，因此我们将细胞接种于预先铺好ECM 胶的培养皿中，发现这样更有助于蜕膜腺
110 上皮细胞的贴壁及生长。
4 结论
综上所述，本研究利用胶原酶消化蜕膜组织，网筛分离及差速贴壁法纯化细胞，建立了
一种经济、高效的培养方法，可获得高纯度的蜕膜腺上皮细胞，为进一步实验研究提供有效
保证。