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P-gp和MDR1在三种乳腺癌细胞中表达差异研究
P-gp 和MDR1 在三种乳腺癌细胞中表达
差异研究#
谌海燕1,陈信义1,2**
基金项目:北京中医药大学自主创新课题(2009TYBZZ-XS057)
作者简介:谌海燕,(1982-),女,在读博士,研究方向:中药治疗乳腺癌应用研究。
通信联系人:陈信义,(1954-),男,教授,博士研究生指导教师. E-mail: chenxinyi0729@126.com
5 (1. 北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科,北京 100700;
2. 北京市与教育部重点实验室(中医内科学),北京 100700)
摘要:目的:比较P-gp 和MDR1 在人乳腺癌敏感细胞(MCF-7/S)和耐药细胞(MCF-7/ADR、
MCF-7/TAM)中的表达差异,初步探讨乳腺癌细胞对阿霉素与对三苯氧胺产生耐药机制的区
别。方法:采用免疫细胞化学法、流式细胞术检测P-gp,采用实时荧光定量PCR 法检测MDR1
10 在三种乳腺癌细胞中的表达情况。结果:在MCF-7/ADR 细胞中P-gp 和MDR1 均呈高表达,阳
性表达率与MCF-7/S 细胞比较,有统计学意义(P<0.01)。在MCF-7/TAM 细胞中P-gp、MDR1
均呈低表达,与MCF-7/S 细胞比较,无统计学意义(P>0.05)。结论:P-gp 和MDR1 的高表
达是乳腺癌细胞对阿霉素产生耐药的主要机制,而并非是乳腺癌细胞对三苯氧胺产生耐药的
机制。
15 关键词:乳腺癌;耐药;P-gp;MDR1
35
与肿瘤患者接受化疗药物一样,雌激素受体阳性的乳腺癌患者长期接受三苯氧胺
(Tamoxifen,TAM)治疗也会产生耐药性。因此,难以提高临床疗效便成为乳腺癌内分泌治
疗中的难题[1]。目前,已知由P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的MDR 是乳腺癌细胞对
化疗药物产生耐药的经典机制[2]。但乳腺癌细胞对内分泌治疗的耐药机制与P-gp 高表达之
40 间的关联性国内未曾见到文献报道。因此,以人乳腺癌敏感细胞(MCF-7/S)、耐三苯氧胺
细胞(MCF-7/TAM)和耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)为对象,研究P-gp 及其编码基因MDR1
在三种乳腺癌细胞中的表达差异,对于了解乳腺癌细胞耐化疗药物与耐三苯氧胺的发生机
制,并选择应对措施具有重要意义。
1 材料
45 1.1 细胞系
人乳腺癌细胞系(MCF-7/S)由中国中医科学院肿瘤研究所林洪生教授惠赠;耐三苯氧
胺的人乳腺癌细胞系(MCF-7/TAM)由美国弗吉尼亚大学医学院内科岳微教授惠赠;耐阿
霉素的人乳腺癌细胞系(MCF-7/ADR)由中南大学湘雅医学院细胞库惠赠。上述三种细胞
均培养在含5%胎牛血清的IMEM 培养基中,耐药细胞于实验前一周撤药。
50 1.2 试剂和仪器
胎牛血清和IMEM 培养基均为Gibco 公司产品;TAM 为Sigma 公司产品;ADR 为
Biobasic Inc 公司产品;流式抗体P-gp 为eBioscience 公司产品;免疫组化多克隆抗体P-gp
购自武汉博士德生物科技有限公司;Trizol 为Invotrigen 公司产品;反转录试剂盒为Promega
产品;SYBR GREENⅠMix 为美国ABI 公司产品;MDR1 引物由北京奥科生物科技有限公
55 司合成。荧光定量PCR 仪为美国Agilent 公司产品,型号Mx3000P;流式细胞仪为
Beckman-Coulter 产品,型号为EPICS-XL;免疫细胞化学图像分析系统为Olympus 产品,
型号为BX60。
2 方法
2.1 免疫细胞化学法检测P-gp 表达
60 将载玻片在1:10 的多聚赖氨酸中浸泡10min,干燥过夜。取对数生长期细胞MCF-7/S、
MCF-7/TAM 和MCF-7/ADR 分别接种于预置载玻片的24 孔培养板内,接种细胞数为2.5×
104 个,37℃ 5%CO2 条件下培养48h。然后用PBS 洗3 次,用4%多聚甲醛常温下固定细胞
20min,再用PBS 洗3 次,最后按照免疫细胞化学试剂盒说明书进行操作,并用图像分析系
统检测P-gp 表达强度。
65 2.2 流式细胞术检测P-gp 表达
取对数生长期细胞接种于6 孔板内,37℃ 5%CO2 条件下培养48h。收集细胞,PBS 洗
2 次,重悬于100μl PBS 中,加P-gp 流式单克隆抗体5μl,混匀,室温避光孵育30min,用
1%多聚甲醛固定,上机检测P-gp 的荧光强度,重复实验3 遍。
2.3 实时荧光定量PCR 法检测MDR1 表达
70 2.3.1 引物
MDR1 基因上游是:tccctctccccgcgactcct,下游是:tcccccttggcatgagatgca,扩增片段长度
为270bp;β-actin 基因上游是:tcctccctggagaagagcta,下游是:tcaggaggagcaatgatcttg,扩增
片段长度为302bp;引物序列方向均是5’端至3’端。
2.3.2 RNA 提取和cDNA 合成
75 细胞培养48h 后,用Invotrigen 公司的Trizol 提取RNA,测A260 和A280 的吸光值,
计算出RNA 浓度,采用M-MLV 逆转录酶按30μl 体系将1.5μg RNA 逆转录成cDNA。反应
体系为:M-MLV 1μl,RNA 酶抑制剂 1μl,Oligo dT 1μl,dNTP 2μl,5×RT-buffer 6μl,RNA
1.5μg,无RNA 酶水补足至30μl。反应条件:42℃ 1h→95℃ 5min,终止反应。合成后的
cDNA 于-20℃保存。
80 2.3.3 实时荧光定量PCR 法
20μl 反应体系:含2×SYBR GREENⅠMix 10μl,MDR1 和β-actin(0.5μg/μl)上、下游
引物各1μl,cDNA 1μl,无RNA 酶水7μl。在ABI Mx3000P 型荧光定量PCR 仪上进行扩增,
反应条件为:95℃ 5min(预变性)→95℃ 30s(变性)→57℃ 30s(退火)→72℃ 30s(延
伸)→72℃ 5min(后延伸),共40 个循环。溶解曲线模式定为:95℃ 1min,55℃ 30s,
85 95℃ 30s。
2.3.4 数据处理与分析
将目的基因在耐药细胞内相对于敏感细胞的表达差异倍数用2-△△Ct 方法计算来表示[3]。
△Ct=Ct(MDR1 基因)-Ct(β-actin 基因),-△△Ct=-(△Ct 耐药细胞-△Ct 敏感细
胞)。当2-△△Ct>1,目的基因表达上调,反之下调。
90 2.4 统计方法
实验数据采用SPSS13.0 统计软件处理,多组均数比较采用单因素方差分析,检验水准
α=0.05,P<0.05 有统计学意义。
3 结果
3.1 免疫细胞化学法检测P-gp 表达结果
95 P-gp 在MCF-7/S、MCF-7/TAM 和MCF-7/ADR 三种乳腺癌细胞中均有表达,阳性表现
为棕黄色颗粒,主要分布在细胞膜和细胞浆内;免疫细胞化学染色与分析结果见图1、表1。
图1 三种乳腺癌细胞中P-gp 的表达(×400)
Fig.1 The expression of P-gp in three breast cancer cells(×400)
100
从图1 可以看出,P-gp 在MCF-7/S、MCF-7/TAM 细胞中呈弱表达,而在MCF-7/ADR
细胞膜与细胞浆具有明显表达。
表1 P-gp 在三种乳腺癌细胞中的表达(
_
x±s,n=6)
105 Tab.1 The expression of P-gp in three breast cancer cells
细胞 P-gp 平均光密度(Average optical density)
MCF-7/S 0.23±0.02
MCF-7/TAM 0.22±0.04△
MCF-7/ADR 0.30±0.02*
注:与MCF-7/S 比较,△P>0.05;*P<0.01
从表1 可以看出,MCF-7/ADR 细胞的P-gp 表达强于MCF-7/S、MCF-7/TAM 细胞,具
有统计学意义(P<0.01);而MCF-7/S 细胞与MCF-7/TAM 细胞比较,无统计学意义(P
110 >0.05)。
3.2 流式细胞术检测P-gp 表达结果
P-gp 在MCF-7/S、MCF-7/TAM 和MCF-7/ADR 细胞中均有表达(见图2)。其中,MCF-7/S
和MCF-7/TAM 细胞中P-gp 平均荧光强度分别为4.32±0.83、5.67±0.76,二者比较,无统计
学意义(P>0.05)。MCF-7/ADR 细胞中P-gp 平均荧光强度为251.4±6.22,与MCF-7/S 细
115 胞相比,有统计学意义(P<0.01)。
图2 P-gp 在三种乳腺癌细胞中的荧光强度比较
Fig.2 The comparison of flμorescence intensity of P-gp in three breast cancer cells
120 3.3 实时荧光定量PCR 检测MDR1 表达结果
从扩增曲线可见待测样品均已进入扩增的平台期,反应条件设定准确(见图3、图4);
溶解曲线单一,未见到杂峰,说明产物特异性较好(见图5、图6)。统计结果显示(见表2)。
表2 MDR1 在三种乳腺癌细胞中的表达
Tab.2 The expression of MDR1 in three breast cancer cells
细胞 ΔCt 2-ΔΔCt P
MCF-7/S 2.14±0.74 1
MCF-7/TAM 2.07±0.12 1.06±0.44△ 0.990
MCF-7/ADR -5.67±0.072 243.95±57.74* 0.008
注:与MCF-7/S 比较,△P>0.05;*P<0.01
从表2 可以看出,130 MCF-7/TAM、MCF-7/S 细胞中的MDR1 表达相比较,无统计学意义
(P>0.05);MCF-7/ADR 细胞中的MDR1 表达明显高于MCF-7/S、MCF-7/TAM 细胞(P
<0.01)。
4 讨论
P-gp 是MDR1 基因编码的一种能量依赖性转运蛋白,最早由Ling 等[4]在对秋水仙碱耐
135 药的中国仓鼠卵巢癌细胞上分离发现。它能将肿瘤细胞内的抗癌药物泵出细胞外,从而降低
细胞内的药物浓度,使抗癌药物的细胞毒性作用减弱或丧失[5-7],导致细胞耐药。P-gp 作为
防御保护机制,在人体正常组织如肠道、肝、肾以及血脑屏障、胎盘屏障的上皮细胞中均有
表达,其目的是对药物或化疗物质的吸收、分布、排泄发挥调控作用,且能抵御外源性毒素
对机体正常组织造成的损伤[8]。而在对化疗药物不敏感或疗效差的肿瘤细胞中P-gp 均为高
140 表达[9]。多项研究结果显示,P-gp 过度表达是乳腺癌对化疗药物产生耐药性的主要原因之一
[10]。但与乳腺癌对内分泌治疗产生耐药性是否有相关性,国内外文献很少报道。
基于上述原因,我们利用免疫细胞化学法、流式细胞术与实时荧光定量PCR 技术检测
了P-gp和MDR1在三种乳腺癌细胞中的表达差异。结果发现,P-gp在MCF-7/S和MCF-7/TAM
细胞中表达无统计学意义(P>0.05);而在MCF-7/ADR 细胞中具有高表达,与MCF-7/S、
145 MCF-7/TAM 细胞比较,具有统计学意义(P<0.01)。实时荧光定量PCR 技术检测的MDR1
基因在三种乳腺癌细胞中表达结果与P-gp 表达结果基本一致。MDR1 及其编码的P-gp 在对
阿霉素耐药的乳腺癌细胞中均呈高表达,在耐三苯氧胺的乳腺癌细胞与敏感的乳腺癌细胞中
表达不明显。结论认为,MDR1 及其编码的P-gp 高表达是MCF-7/ADR 细胞的主要耐药机制,
而与MCF-7/TAM 细胞耐药机制无明显相关性。
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