合欢花水提物对大鼠脑胶质瘤C6 细胞株的
增殖抑制与凋亡诱导作用#
昝亚伟，张立伟，陈廷贵**
基金项目：教育部博士点新教师基金(200801081033)；国家自然科学基金(30772759)
作者简介：昝亚伟，（1986-），女，硕士研究生，主要研究方向：天然药物化学。
通信联系人：陈廷贵，（1966-），男，副教授，主要研究方向：天然药物化学，生物信息学. E-mail:
chentg@sxu.edu.cn
5 （山西大学分子科学研究所，太原 030006）
摘要：目的：探讨合欢花水提物对大鼠脑胶质瘤细胞C6 的增殖抑制与凋亡诱导作用。方法：
采用MTT 法检测合欢花水提物对C6 细胞增殖活力的影响，琼脂糖凝胶电泳检测该水提物对
C6 细胞的诱导凋亡作用。结果表明：合欢花水提物能抑制C6 细胞的增殖，且具有剂量和时
间依赖性，其抑制C6 细胞增殖机理可能与诱导细胞凋亡途径有关。研究发现：50ug/ml 合
10 欢花水提物作用C6 细胞24h 后，对C6 细胞的增殖抑制率为37.5%，而50ug/ml 顺铂对C6
细胞的增殖抑制率仅为24.9%，提示合欢花水提物对C6 细胞增殖的抑制作用发挥快而强，
有望成为治疗脑胶质瘤的有效的新药。
关键词：合欢；C6 细胞株；细胞增殖；细胞凋亡
中图分类号：0629
 0 引言
35 脑神经胶质瘤（脑胶质细胞瘤，glioma cell）是一种发生于成人中的常见的颅内恶性肿
瘤，其发病率为5/100,000[1]，平均生存期仅9-12 个月[2]。 由于脑胶质瘤是一种具有高增殖
性、高侵袭性且血管丰富的肿瘤，经手术切除，术后辅助放、化疗的脑胶质瘤患者的生存率
仍较低[3]。作为祖国传统医学，中医中药在癌症治疗中尤其是对放化疗有减毒增效作用，并
且经济上比较便宜，服用方便，越来越受到广大癌症病人的青睐。
40 合欢花是豆科植物合欢（Albizzia julibrissin Durazz）的干燥花序，是一种广泛分布的传
统中药，性平味苦，具有解郁理气，安神活络之功效[4]。文献报道合欢同属（如光叶合欢
 Alibizzia Lucidior I. Nielsen, ALN[5]）、同科（如山豆根 Radix Sophora Tonkinensis, RST[6]）
植物具有广泛的体内、体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，但有关合欢在肿瘤中的研究鲜有文献
报道，为此，我们通过对包括合欢花在内的9 种传统中药分别进行了水提和醇提，以大鼠脑
45 神经胶质瘤细胞C6 为研究对象，通过MTT 实验进行活性筛选，发现3 种药物对C6 细胞的
增殖具有抑制作用，合欢花即是其中之一，并进一步对合欢花水提物对C6 细胞的诱导凋亡
作用进行了研究。
1 材料仪器
1.1 细胞株
50 大鼠脑胶质瘤C6 细胞株由山西大学分子科学研究所袁彩霞老师馈赠。
1.2 药物及主要试剂
合欢花购自河北康派中药有限公司，产于浙江；高糖DMEM 完全培养基购自Gibco 公
司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司； MTT、DMSO 购自Solarbio(From Amresco)；
医用顺铂（10mg/瓶）购自齐鲁制药有限公司；细胞凋亡-DNA Ladder 抽提试剂盒（离心柱
55 式）购自碧云天生物技术研究所（产品编号C0008）；100bp Plus DNA Ladder 购自Fermentas；
琼脂糖购自Invitrogen；无水乙醇为天津三厂产品；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
Midea 电磁炉；himac CR22G 高速离心机；SH2-CB 真空抽滤泵（河南巩义市予华仪器
有限公司）； SENCO R50 旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；Scienz-12N 冷冻干燥机
60 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；真空干燥箱；超净台；Heal Force HF600W CO2 培养
箱（上海力申科学仪器有限公司）；BIO-RADModel 酶标仪；电泳仪（北京六一仪器厂）。
2 实验方法
2.1 合欢花的提取
干燥合欢花经中药粉碎机粉碎后，称取50g，用1000ml 的蒸馏水沸水煮2 次，每次1.5h，
65 用纱布粗滤，合并两次的药液，8000rpm 离心10min，取上清进行真空抽滤，滤液用旋转蒸
发仪进行减压浓缩，最后将浓缩后的组分用冷冻干燥机冷冻干燥，得到的干物质即为合欢花
水提物，得率为10.6%。
2.2 MTT 法检测细胞增殖抑制作用
MTT 实验参照文献[7]。取对数生长期C6 细胞按2×105/ml 的密度接种于96 孔板，每
70 孔200μl，放细胞培养箱进行培养，待细胞贴壁后加药，每孔20μl，使药物的终浓度分别为
10、25、50、75、100、250、500、750、1000μg/ml，以只加溶剂PBS 为对照，并设顺铂阳
性对照组，每组设5 个复孔。实验结束前4h 每孔加入20μl 的MTT 溶液（5mg/ml , PBS 配
制），放培养箱继续培养4h 后终止培养。小心弃去孔内培养液，每孔加入150μl DMSO，
置摇床上低速振摇10min 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定490nm 波长处各孔
75 光吸收值。根据如下公式计算细胞增殖抑制率：
抑制率（%）=（1-OD 实验组/OD 对照组）×100
分别设空白对照组（溶剂）、阳性对照组（50ug/ml 顺铂）、实验组（合欢花水提物）。
 实验重复3 次。
2.3 凋亡细胞DNA ladder 抽提
80 采用碧云天生产的细胞凋亡-DNA Ladder 抽提试剂盒，分别收集各实验组与对照组细
胞，按照说明书进行操作。提取到的DNA 在1.8%琼脂糖，80V 电压下电泳1.5h 后，用凝
胶成像仪照相。
2.4 统计学方法
MTT 实验中的吸光度值以平均值±标准差（Mean ± SD）表示，用Origen 8.0 软件进行
85 统计学处理，根据细胞增殖抑制率公式算得每次实验各浓度药物对C6 细胞的增殖抑制率后，
最后取三次结果的平均值作为该浓度药物对C6 细胞的增殖抑制率。
3 结果
3.1 合欢花水提物对C6 细胞增殖活力的影响
为了观察合欢花水提物对C6 细胞增殖活力的影响，采用MTT 法测定不同浓度合欢花
90 水提物作用C6 细胞不同时间（24h、48h、72h）后对细胞增殖能力的影响。
合欢花各浓度提取物对C6 细胞的增殖均有抑制作用，其中，低剂量组（10ug/ml）对
C6 细胞的增殖抑制率较低，分别为16%、7%、13% ，但随着细胞给药浓度的增加，其对
C6 细胞增殖抑制率迅速增加，具有明显的量效依赖关系；达到一定浓度后，抑制率增加缓
慢，高剂量组（1000ug/ml）作用细胞相应时间后基本上不存在活细胞（图1）。
0 200 400 600 800 1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
inhibition rate(%)
concentration(ug/ml)
24h
inhibition rate(%)
concentration(ug/ml)
48h
inhibition rate(%)
concentration(ug/ml)
A B C 72h
95
图1 不同浓度合欢花水提物对C6 细胞增殖活力的影响
Fig 1 The effect of water extract of AJDF on the proliferation of C6 cell lines
在同一浓度药物作用下（50、75、100、250、500、750、1000ug/ml），随着作用时间
100 的延长，对C6 细胞的增殖抑制率也增加，提示合欢花水提物在此浓度范围内对C6 细胞的
增殖抑制作用具有时间依赖性（图2, A-G）。而在低浓度时（10、25ug/ml）对C6 细胞的增
殖抑制作用不具时间依赖性。50ug/ml 顺铂作用C6 细胞24h、48h、72h 时对其增殖抑制率
分别为24.9%、69.1%、85.5%（图2, H）。
 0 24 48 72 96
0
10
20
30
40
50
60
inhibition rate(%)
time(h)
50ug/ml
0 24 48 72 96
0
10
20
30
40
50
60
70
inhibition rate(%)
time(h)
75ug/ml
0 24 48 72 96
0
10
20
30
40
50
60
70
inhibition rate(%)
time(h)
100ug/ml
0 24 48 72 96
0
20
40
60
80
inhibition rate(%)
time(h)
250ug/ml
0 24 48 72 96
0
20
40
60
80
inhibition rate(%)
time(h)
500ug/ml
0 24 48 72 96
0
20
40
60
80
100
inhibition rate(%)
time(h)
750ug/ml
0 24 48 72 96
0
20
40
60
80
100
inhibition rate(%)
time(h)
1000ug/ml
0 24 48 72 96
0
20
40
60
80
inhibition rate(%)
time(h)
cDDP(50ug/ml)
A B C D
E F G H
图2 合欢花水提105 物作用C6 细胞24h、48h、72h 后对C6 细胞增殖活力的影响
A-G 依次为：50ug/ml、75ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml、750ug/ml、1000ug/ml 的合欢花水提物；
H 为阳性对照（50ug/ml 的顺铂）.
Fig 2 The effect of water extract of AJDF on the proliferation of C6 cell lines at 24,48,72h
A-G is experimental groups, the concentration of AJDF water extract is respectively 50、75、100、250、500、
110 750、1000ug/ml; H: positive control group (50ug/ml cDDP).
3.2 DNA 梯状带的检测
琼脂糖凝胶电泳结果显示，500、750、900、1000ug/ml 合欢花水提物处理C6 细胞24h
后，可观察到典型的DNA 梯状条带，低于500ug/ml 时只能看见模糊的DNA swear，对照组
115 仅有大于3000bp 的基因组DNA（图3）。
图3 琼脂糖凝胶电泳检测合欢花水提物诱导的C6 细胞凋亡
1:对照组；2-8:实验组，加药浓度分别为50、100、250、500、750、900、1000ug/ml；M:分子量标准.
Fig 3 C6 apoptosis induced by water extract of AJDF
120 1: control group; 2-8: experimental groups，medicine concentration is respectively 50, 100, 250, 500, 750, 900,
1000ug/ml; M: Moleculor marker.
 4 讨论与展望
现代研究认为，肿瘤的发生和发展是肿瘤细胞增殖失控的结果，过度的细胞增殖增加了
125 细胞恶变的潜能，进而导致肿瘤的发生[8]。从古至今，科研人员通过长期的努力探索，发现
许多草本和植物有良好的药效作用，一些已成为临床用药，如来自于草麻黄中的麻黄碱已成
为抗哮喘药 [9]。通过对植物、动物、海底有机物、微生物中天然产物的筛选发现许多治疗
癌症的药物[10]，如：源于植物中的复合物长春新碱(Vincristine)、伊立替康(irinotecan)、依托
泊苷(etoposide)、紫杉酚(paclitaxel)。
130 据北美、欧洲、日本抗癌药物市场1981-2006 年间的分析数据显示：155 种临床应用的
抗癌药物中47.1%源于未经修饰的天然产物或天然产物的衍生物或是以天然产物复合物药
效基团为基础设计合成的药物[11]。从包括植物在内的自然界中寻找发现高效低毒的抗癌活
性成分或先导化合物一直是国内外药物学家十分关注的课题和研究的热点[12]。用中草药治
疗癌症在我国有着悠久的历史和丰富的临床经验，用现代的方法研究其活性成分及其作用机
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