纳米金溶胶细胞毒性的研究#
万锡铮1，郑海霞2，龚龑2**
基金项目：国家自然科学基金（NSFC21002006)；北京市教委项目（AJ2010-08）
作者简介：万锡铮，（1994 年-），男，主要研究方向为新材料研究
通信联系人：龚龑，（1980 年-），男，副教授，主要研究方向为应用化学及生物化学技术. E-mail:
clygy@bift.edu.cn
（1. 首都师范大学附属中学，北京 100048；
5 2. 北京服装学院材料科学与工程学院，北京 100029）
摘要：本文主要研究纳米金溶胶的细胞毒性。通过[3H]-TdR 掺入法研究了粒径在15-20nm
的纳米金溶胶，溶胶中含有的柠檬酸钠溶液，以及溶胶中含有的柠檬酸钠与PVP 混合溶液对
正常细胞（人体表皮细胞、人体皮肤成纤维细胞）和癌细胞（HeLa 细胞、K562 细胞）活性
的影响。实验结果为当浓度小于50μmol/L 时，随浓度的增加，其对正常细胞增殖的促进作
10 用增加；而后随浓度的增加促进作用减弱，并逐步转化为对正常细胞增殖的抑制作用。当纳
米金的浓度不大于50μmol/L 时，纳米金对癌细胞的细胞活性没有明显影响；浓度大于50
μmol/L 时，随浓度的增加，对癌细胞抑制作用增强。由此可以看出，纳米金溶胶中含有的
柠檬酸钠与PVP 对这四种细胞的活性基本没有影响，可以在一定浓度范围内促进人体正常皮
肤细胞的增殖，具有剂量依赖性和时间依赖性；对于癌细胞的影响，则需高于一定浓度（50
15 μmol/L）才有显著的抑制作用。
关键词：细胞生物化学；钠米金溶胶；[3H]-TdR 掺入法；细胞毒性
 0 引言
近年来，多家权威杂志相继发表文章探讨纳米尺度材料的生物效应,表明纳米材料对环
境和健康的潜在影响以及纳米危害和安全性的研究已经提升到相当的战略高度[1-5]。本研究
在细胞水平探讨了纳米金的安全性。纳米金独特的生化与物化性质使其在免疫分析、生物传
45 感器、DNA 的识别与检测、基因治疗等许多方面有独特的作用[6-13]。纳米金对蛋白质、DNA
 等有很强的吸附功能，而且不会改变被吸附物质的性质，作为性质优良的药物载体也被广泛
的研究[6, 14]。随着纳米金的广泛应用，其安全性亦是大家关注的焦点，本文通过3H-TdR 掺
入试验在细胞水平探讨纳米金的安全性，为开发纳米金的应用提供实验依据。
1 材料及方法
50 1.1 材料
人表皮细胞、HSF 细胞、HeLa 细胞、K562 细胞（购自协和细胞库），DMEM 培养基、
RPMI-1640（Invitrogen 公司）、PBS 缓冲液、DMEM 培养基、谷氨酰胺、双抗（青、链霉
素）、胰蛋白酶、冻存液（Invitrogen 公司）、胎牛血清（Invitrogen 公司）、无水乙醇、
乙二胺四乙酸（EDTA）（购自北京化工厂），3H-TdR（中国同位素公司），液闪液：SuperMix
55 （PE 公司），液体闪烁分析仪1450：（MicroBeta 公司）。自制的两种纳米金溶胶(纳米金
溶胶1--以柠檬酸钠还原氯金酸不加入保护剂PVP 制得的纳米金颗粒,纳米金2: 以柠檬酸钠
还原氯金酸并且加入保护剂PVP 制得的纳米金颗粒) ,纳米金溶胶1 中纳米金颗粒是球形与
准球形，且局部有团聚现象。纳米金颗粒平均粒径在16nm 左右。纳米金溶胶2 中纳米金颗
粒为球形，基本不团聚，纳米金颗粒粒径在15nm 左右，并且粒径比较均匀，分散性好，这
60 是因为PVP 能促进纳米金颗粒的分散，有效地阻止纳米金小颗粒之间的团聚，起到很好的
保护作用[15]。
1.2 主要仪器
SZ-93 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），二氧化碳培养箱（BPN-CRH，
上海一恒科技有限公司），超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司），电热
65 恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A，上海精宏实验设备有限公司），倒置显微镜：（Olympus
公司），离心机（Eppendorf 公司）
1.3 方法
1.3.1 细胞的培养
人体表皮细胞、HSF 细胞、HeLa 细胞、用含10%胎牛血清，100U/ml 青霉素和链霉素
70 的DMEM 培养基，置于37℃、5% CO2 的孵育箱（BPN-CRH）内培养，以后每三天换培养
基，待细胞80%汇合后，用0.25%胰蛋白酶加0.02%的乙二胺四乙酸（EDTA）消化传代。
K562 细胞,培养液为含10％胎牛血清,终浓度为100 U／ ml 的青霉素和链霉素的
RPMI-1640(购于Invitrogen 公司)液体培养体系，置37℃、5％CO2 恒温培养箱中培养，每两
天换液一次，实验选用对数生长期细胞。
75 1.3.2 [3H]-TdR 掺入实验法测定纳米金对细胞活性的影响
将消化配制好的细胞悬液移入96 孔板，使每孔细胞数为5×l04 个/L，培养24 h 后，换
成含有不同浓度的纳米金培养基,测试纳米金对细胞影响的剂量依赖性,即培养细胞的培养基
中含有不同浓度的纳米金(3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、
100μmol/L、200μmol/L)，在含5％CO2 培养箱内继续培养24 h，然后加入[3H]-TdR(3.7×
80 107Bq/L)，再继续孵育6 h 后，终止反应，经一2 型微量多头细胞收集器抽滤收集细胞于9999
型玻璃纤维滤纸上，滤纸经红外线烘干后置入闪烁瓶中，加入PPO／POPOP／二甲苯闪烁
液，用液闪计数器测定[3H]-TdR 掺入量。通过测试不同浓度的纳米金对细胞的增殖情况的
 影响，选择特定浓度，再做纳米金对细胞增殖影响的时间依赖性，即特定的纳米金浓度下分
别对细胞作用24 小时的CPM 值、48 小时的CPM 值、72 小时的CPM 值。
85 1.4 统计学方法
不同纳米金不同浓度作用后，数据表示为：平均值±标准偏差：数据分析采用SPSS16.0,t
检验做差异性分析。
2 结果与讨论
2.1 纳米金溶胶对细胞活性影响的剂量依赖性
90 纳米金溶胶对细胞活性影响的剂量依赖性，对所选取的正常细胞（HSF 细胞、人体包
皮细胞）和癌细胞（HeLa 细胞、K562 细胞）作用不同。下面分别从这两方面进行结果说明。
与对照组相比，经t 检验可知：纳米金溶胶1 对人体皮肤成纤维细胞HSF 活性的影响
（表1），在纳米金1 浓度为100μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L
时均为P＞0．05，无显著差异，而在50μmol/L 时P＜0.01,纳米金溶胶1 明显促进细胞增殖；
95 纳米金溶胶2 对人体成纤维细胞HSF 活性的影响（表2），在纳米金2 浓度为12.5μmol/L、
6.25μmol/L、3.125μmol/L 时均为P＞0．05，无显著差异，在纳米金2 浓度为50μmol/L、
25μmol/L 时均为P＜0．05（具有显著性差异），纳米金溶胶2 明显促进细胞增殖；纳米金
溶胶1 对人体表皮细胞活性的影响（表3），在纳米金1 浓度为100μmol/L、25μmol/L、
12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L 时均为P＞0．05，无显著差异，而在50μmol/L 时，
100 P＜0.01,纳米金溶胶1 明显促进细胞增殖。
以不同浓度组CPM 值为纵坐标，作用浓度值为横坐标，绘制柱状图（图1），可看出，
在纳米金浓度小于50μmol/L 时，CPM 值随着浓度的增加稍有增加，即细胞随着纳米金浓度
的增加HSF 细胞、人体表皮细胞增值效应增强，但与对照组相比，没有显著性差异，浓度
100μmol/L、200μmol/L 时，CPM 值小于对照组CPM 值，均有在50μmol/L 时出现最大显著
105 性差异，为转折点，纳米金浓度过大时，又将抑制细胞增殖。
在光镜下，对照组的HSF 细胞生长旺盛，呈梭形， 大小均一， 排列规则，呈涡旋状
或者放射状排列，胞体光滑；实验组的细胞形态学上没有改变，在纳米金1 浓度为50μmol/L
时，细胞明显增多，表现为细胞数目明显增加，排列规则紧密，呈涡旋状或者放射状排列。
纳米金其它浓度细胞数目与对照组看不出数目的差别，但可看出细胞的形态没有变化
110
表1 纳米金溶胶1 对HSF 细胞增殖的影响
Tab.1 The effect of gold nanoparticle colloid 1 to the proliferation of HSF cells
纳米金1 浓
度(μmol/L)
24h CPM
200 2578.0±132.57b
100 2843.7±134.53a
50 3781.0±175.50b
25 3247.3±115.52a
12.5 3155.3±88.62a
6.25 3091.0±141.63a
3.125 3052.7±134.97a
浓
度
选
择
0（对照） 3030.7±101.44
注：与对照组相比，aP＞0.05，bP＜0.01
 表2 纳米金溶胶2 对HSF 细胞增殖的影响
Tab.2 The effect of gold nanoparticle colloid 2 to the proliferation of HSF cells
纳米金2 浓
度(μmol/L)
24h CPM
200 2557.7±130.62c
100 2892.0±121.26b
50 3619.7±208.65b
25 3448.7±130.89b
12.5 3344.7±100.17a
6.25 3272.0±160.15a
3.125 3195.0±102.53a
浓
度
选
择
0(对照) 3170.3±85.44
注：与对照组相比:aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01
120
表3 纳米金溶胶1 对人体表皮细胞作用试验结果
Tab.3 The effect of gold nanoparticle colloid 1 to human skin cells
纳米金1 浓
度μmol/L
24h CPM
200 2645.5±88.39a
100 2787.0±130.11a
50 3780.5±248.19b
25 3286.5±132.23a
12.5 3206.5±0.71a
6.25 3022.0±107.48a
3.125 2981.0±74.95a
浓度
选择
0(对照) 3087.5±34.65
注:与对照组相比：aP ＞0.05，bp＜0.01
* *
*
*
**
*
**
0
1000
2000
3000
4000
5000
200 100 50 25 12.5 6.25 3.125 0
μM
cpm
* *
*
** **
**
***
0
1000
2000
3000
4000
5000
200 100 50 25 12.5 6.25 3.13 0
μM
cpm
* * * *
**
*
*
0
1000
2000
3000
4000
5000
200 100 50 25 12.5 6.25 3.13 0
μM
cpm
125
① ② ③
① 纳米金1 不同浓度对HSF 细胞增殖的影响 ②纳米金溶胶2 对HSF 细胞增殖的影响
③纳米金溶胶1 对人体表皮细胞作用试验结果
图1 纳米金溶胶对HSF 细胞、人体表皮细胞活性影响的剂量依赖性
130 Fig.1 Dose-dependent effect of gold nanoparticle colloids to HSF cells and human skin cells
纳米金溶胶1、纳米金溶胶2 对HeLa 细胞、K562 细胞的影响，与对照组相比（图2），
经t 检验可知，在纳米金1、纳米金2 浓度为50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、
3.125μmol/L 时均为P＞0．05，无显著差异，都是在浓度为50μmol/L 时出现转折，随纳米
135 金浓度的再增加，CPM 值明显减小，对细胞的抑制效应增强，在200μmol/L 时，均有P﹤
0.01，表明在200μmol/L 时，纳米金溶胶1、纳米金溶胶2 对HeLa 细胞、K562 细胞均有显
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