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【摘要】 随着“吸烟与健康”的矛盾日益显著,低危害卷烟的开发越来越受到烟草研究者的广泛关注。我国拥有丰富的中草药资源及深厚的中医理论基础,运用中草药减轻卷烟烟气对健康的危害已成为发展低危害中式卷烟的特色之路。本论文通过筛选具有降低卷烟烟气中氰化氢作用的中草药,研制出黄连生物碱复合卷烟滤嘴,并研究了该复合滤嘴对卷烟烟气中其它有害成分的影响；采用离体实验研究了黄连生物碱复合滤嘴降低卷烟烟气对口腔过氧化物酶活性的抑制作用机理；通过检测经烟气熏染的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)氧化应激反应,研究了黄连生物碱添加在滤嘴中抑制由卷烟烟气刺激引用的细胞氧化应激。实验方法与结果如下：1.植物生物碱的筛选及提取采用乙醇浸提法对大量中草药进行生物碱提取,使用Dragendorff试剂、Mayer试剂、Wagner试剂等生物碱检测试剂鉴定,筛选出中草药醇提物经去脂处理后含生物碱的10种中草药,分别为黄连、黄柏、川贝母、荷叶、粉防己、八仙草、延胡索、百部、萝芙木和三尖杉,将提取到的以上10种中草药的生物碱以30mg/cig的添加量添加到卷烟滤嘴中,与空白卷烟对照,黄连生物碱以18.3%的清除率成为10种中草药生物碱中对氰化氢清除效果最好的植物生物碱。采用大孔树脂和硅胶柱等天然产物分离纯化技术对黄连生物碱进一步分离纯化。经HPLC鉴定,分离纯化后制得的黄连总生物碱及其单体小檗碱、巴马汀和黄连碱的纯度都在95%以上。2.黄连生物碱复合滤嘴对卷烟烟气中有害成分的影响通过黄连生物碱载体的选择,确定将活性炭纤维(ACF)作为黄连生物碱的载体,经吸附参数优化后,制定出ACF负载黄连生物碱的最佳工艺,并设计了一种黄连生物碱复合滤嘴的制作方法。采用国家标准和行业标准对卷烟烟气进行分析,用15mg ACF负载1.5mg黄连生物碱添加在滤嘴中制成的黄连生物碱复合滤嘴可分别降低卷烟烟气中氰化氢和苯并[a]芘含量20%以上,对烟气自由基含量清除率达50%以上。与同牌号的醋纤滤嘴卷烟进行烟气感官对比评吸,黄连生物碱复合滤嘴可增加烟气细腻柔和程度,对卷烟感官品质没有负面影响。3.黄连生物碱降低卷烟烟气中有害成分的机理研究运用离体清除实验对黄连生物碱复合滤嘴的减害机理进行研究,结果表明,黄连生物碱复合滤嘴可清除氰化钾溶液中的氰离子58.7%,而醋纤滤嘴材料和ACF材料对同浓度氰化钾溶液中氰离子的清除率仅为5.3%和17.4%；采用苯并[a]芘荧光淬灭实验研究黄连生物碱单体对苯并[α]芘的作用,结果表明,黄连生物碱单体的浓度对苯并[α]芘荧光淬灭呈线性相关,相关系数为0.991-0.998,结合常数为2.0×103～9.0×103,三种黄连生物碱单体对苯并[α]芘的荧光淬灭作用强度为巴马汀>小檗碱>黄连碱；在黄连生物碱清除自由基的离体实验中,黄连生物碱表现出对DPPH自由基、氮氧自由基、超氧自由基的清除活性,其抗氧化活性的大小顺序为：巴马汀>黄连总生物碱>小檗碱>黄连碱。4.黄连生物碱抑制卷烟烟气引起的口腔过氧化物酶活性降低的作用通过卷烟烟气对唾液的熏染实验,研究了黄连生物碱添加在滤嘴中对烟气抑制口腔过氧化酶(OPO)活性的影响,并在唾液中分别添加抗氧化剂、烟气成分、螯合剂等成分,以及唾液透析法研究了卷烟烟气中抑制OPO活性的主导因子。实验结果表明,与醋纤滤嘴卷烟比较,黄连生物碱复合滤嘴可降低卷烟烟气对OPO活性的抑制率25%以上；抗氧化剂、单支卷烟烟气中主要羰基化合物和烟碱的量对OPO活性都无显著性影响,通过在唾液中添加氰离子、螯合剂以及透析法说明氰离子是烟气中抑制OPO活性的主要因素；黄连生物碱复合滤嘴通过降低卷烟烟气中的氰化氢而降低了烟气对OPO活性的抑制作用。5.黄连生物碱复合滤嘴减轻卷烟烟气对细胞的氧化损伤选用人支气管上皮细胞(BEAS-2B),研究了卷烟烟气对细胞氧化应激损伤的影响。MTT实验结果表明,醋纤滤嘴组、ACF复合滤嘴组和黄连生物碱复合滤嘴组的烟气溶液(CSS)对BEAS-2B细胞的半致死量LD50分别为5.21×10-3、6.32×10-3、7.26×10-3cig/mL;细胞ROS水平及MDA含量测定结果表明,与醋纤滤嘴组和ACF复合滤嘴组比,黄连生物碱复合滤嘴可降低卷烟烟气对BEAS-2B细胞ROS水平的增高及导致的脂质过氧化。黄连生物碱复合滤嘴组CSS对BEAS-2B细胞的总抗氧化能力、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性具有诱导作用,对总SOD活性具有抑制作用,与对照卷烟组比较,黄连生物碱复合滤嘴可减轻卷烟烟气对细胞的氧化应激损伤。
【关键词】 黄连生物碱； 卷烟烟气； 口腔过氧化物酶； 细胞毒性； 氧化应激；
摘要 8-10
Abstract 10-12
第1章 文献综述 13-37
1.1 概述 13
1.2 卷烟烟气中的有害成分 13-18
1.2.1 无机化合物类 14-15
1.2.2 多环芳烃类 15
1.2.3 亚硝胺 15-16
1.2.4 芳香胺 16
1.2.5 羰基化合物 16-17
1.2.6 挥发性有机化合物 17
1.2.7 半挥发性有机化合物 17
1.2.8 挥发性酚类化合物 17
1.2.9 有害元素 17-18
1.2.10 烟气自由基 18
1.3 中草药提取物在降低卷烟烟气危害中的应用 18-25
1.3.1 中草药提取物在降低卷烟烟气有害成分中的作用 19-23
1.3.2 中草药有效成分的提取分离技术 23
1.3.3 中草药在卷烟中的添加方式 23-24
1.3.4 中草药提取物在卷烟中应用的毒理学评价 24-25
1.4 黄连生物碱及其在卷烟中的应用 25-27
1.4.1 黄连生物碱的化学成分及其药用价值 25-26
1.4.2 黄连生物碱的药用安全性 26
1.4.3 黄连生物碱在卷烟中的应用 26-27
1.5 立题依据和研究背景 27-28
1.6 研究的主要内容 28
1.7 创新点 28-29
1.8 本章参考文献 29-37
第2章 中草药的筛选和植物生物碱的提取 37-47
2.1 引言 37
2.2 实验材料、试剂与仪器 37-38
2.2.1 实验材料与试剂 37
2.2.2 实验仪器 37-38
2.3 实验方法 38-41
2.3.1 大量中草药生物碱的提取 38
2.3.2 中草药生物碱的定性检测 38-39
2.3.3 降低卷烟烟气中氰化氢含量的中草药筛选 39-40
2.3.4 黄连生物碱的分离提取 40-41
2.3.5 黄连生物碱的检测方法 41
2.4 结果与讨论 41-44
2.4.1 浸提溶剂的选择 41
2.4.2 大量中草药初步筛选结果 41
2.4.3 降低卷烟主流烟气中氰化氢释放量的中草药筛选 41-42
2.4.4 黄连生物碱的提取分离 42-44
2.5 小结 44-45
2.6 本章参考文献 45-47
第3章 黄连生物碱对卷烟主流烟气的影响 47-65
3.1 引言 47
3.2 实验材料,试剂与仪器 47-48
3.2.1 实验材料与试剂 47-48
3.2.2 实验仪器 48
3.3 实验方法 48-52
3.3.1 黄连生物碱载体的选择 48-49
3.3.2 黄连生物碱复合滤嘴的制作方法 49
3.3.3 卷烟主流烟气成分的测定方法 49-52
3.3.4 卷烟感官评吸实验 52
3.4 结果与分析 52-63
3.4.1 不同载体的吸附效果 52-53
3.4.2 活性炭纤维用量、吸附时间、溶液pH值及温度对吸附能力的影响 53-55
3.4.3 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟烟气焦油、烟碱、CO释放量的影响 55-56
3.4.4 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟主流烟气中氰化氢释放量的影响 56-57
3.4.5 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟主流烟气中氨释放量的影响 57
3.4.6 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟主流烟气中主要羰基化合物的影响 57-58
3.4.7 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟主流烟气中酚类化合物的影响 58-59
3.4.8 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟主流烟气总粒相物中苯并[α]芘含量的影响 59-60
3.4.9 黄连生物碱复合滤嘴对卷烟主流烟气中自由基含量的影响 60-63
3.4.10 卷烟感官评吸结果 63
3.5 小结 63-64
3.6 本章参考文献 64-65
第4章 黄连生物碱降低卷烟烟气中有害成分的机理研究 65-79
4.1 引言 65
4.2 实验材料,试剂与仪器 65-66
4.2.1 实验材料与试剂 65
4.2.2 实验仪器 65-66
4.3 实验方法 66-69
4.3.1 黄连生物碱复合滤嘴材料对氰离子的清除作用 66
4.3.2 黄连生物碱对苯并[α]芘的荧光猝灭作用 66-67
4.3.3 黄连生物碱对自由基的清除作用 67-69
4.4 结果与分析 69-75
4.4.1 黄连生物碱通过ACF负载后对氰离子的清除作用 69-70
4.4.2 黄连生物碱对苯并[α]芘的荧光猝灭作用 70-71
4.4.3 黄连生物碱对自由基的清除作用 71-75
4.5 小结 75-76
4.6 本章参考文献 76-79
第5章 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对口腔过氧化物酶活性的影响 79-91
5.1 引言 79
5.2 实验材料,试剂与仪器 79-80
5.2.1 实验材料与试剂 79-80
5.2.2 实验仪器 80
5.3 实验方法 80-82
5.3.1 唾液样本采集 80
5.3.2 唾液熏染烟气实验 80-81
5.3.3 口腔过氧化物酶活性检测 81
5.3.4 抗氧化剂对经烟气熏染的唾液OPO活性影响 81
5.3.5 烟气中主要羰基类化合物对唾液中OPO活性的影响 81-82
5.3.6 烟碱对唾液中OPO活性的影响 82
5.3.7 透析作用对经烟气熏染的唾液OPO活性影响 82
5.3.8 氰化钾对唾液中OPO活性的影响 82
5.3.9 钴胺素对烟气熏染唾液中OPO活性的影响 82
5.4 结果与分析 82-88
5.4.1 黄连生物碱复合滤嘴卷烟对口腔过氧化物酶活性的影响 82-84
5.4.2 抗氧化剂对烟气熏染唾液中OPO活性的影响 84-85
5.4.3 烟气中主要羰基类化合物对唾液中OPO活性的影响 85-86
5.4.4 烟碱对唾液中OPO活性的影响 86
5.4.5 透析作用对经烟气熏染的唾液OPO活性影响 86-87
5.4.6 氰化钾对唾液中OPO活性的影响 87
5.4.7 钴胺素对烟气熏染唾液中OPO活性的影响 87-88
5.5 小结 88-89
5.6 本章参考文献 89-91
第6章 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞内氧化应激作用的影响 91-107
6.1 引言 91
6.2 实验材料,试剂与仪器 91-92
6.2.1 实验材料与试剂 91
6.2.2 实验仪器 91-92
6.3 实验方法 92-97
6.3.1 卷烟烟气溶液的制备 92
6.3.2 细胞培养 92-93
6.3.3 细胞总蛋白的提取 93
6.3.4 细胞总蛋白含量的测定 93
6.3.5 卷烟烟气的细胞毒性实验 93-94
6.3.6 细胞内ROS水平测定 94
6.3.7 细胞脂质过氧化(MDA)测定 94
6.3.8 细胞总抗氧化能力测定 94-95
6.3.9 细胞总SOD活性的测定 95-96
6.3.10 细胞中过氧化氢酶活性的测定 96-97
6.3.11 细胞中谷胱甘肽还原酶活性的测定 97
6.4 结果与分析 97-103
6.4.1 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞毒性的影响 97-98
6.4.2 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞内ROS水平的影响 98-99
6.4.3 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞MDA水平的影响 99-100
6.4.4 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞总抗氧化能力的影响 100-101
6.4.5 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞总SOD活性的影响 101
6.4.6 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞过氧化氢酶活性的影响 101-102
6.4.7 黄连生物碱复合滤嘴卷烟烟气对细胞GR活性的影响 102-103
6.5 小结 103-105
6.6 本章参考文献 105-107
结论与展望 107-111
攻读博士学位期间发表的学术论文 111-113
致谢 113
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