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中等强度运动大鼠左心室肌蛋白质组的差异性表达 摘要：目的：从蛋白质组学的角度探讨在中等强度有氧运动应激条件下，左室肌蛋白质组的 差异表达及其规律，为研究有氧运动对心肌蛋白质的影响、有效地提高心功能水平提供依据。 方法：将20 只SD 雄性大鼠随机分为对照组和实验组，以跑台运动的方式，复制递增运动 负荷至24m•min-1，持续运动40min 的中等强度运动实验动物模型；实验组在末次训练6 小 10 时后与对照组同时麻醉处死，取左室肌，提取左室肌组织的全蛋白进行双向凝胶电泳分离； 运用ImageMaster 2D Platinum 图像分析软件对2-DE 胶进行分析。结果：左室肌蛋白质组的 分离结果是运动组的蛋白质点为478±7 个，对照组为563±24 个；运动后差异表达的蛋白质 点共有45 个，这些蛋白质点主要集中在分子量为10～70kD，等电点为5～8 之间；表达量 上调至2 倍以上的有27 个，下调至1/2 以下的点有16 个，其中表达量上调至5 倍以上的点 15 有7 个，下调至1/5 以下的点5 个。结论：在中等强度有氧运动后，大鼠左室肌蛋白质组的 表达量发生了明显变化。心肌能量代谢水平提高，运动大鼠心脏出现良好的适应性变化。 关键词：运动心脏；蛋白质组；左室肌；中等强度运动；双向凝胶电泳 Moderate intensity exercise on rat left ventricular muscle proteome differential expression Abstract: Objective: From the perspectives of proteomics in the moderate-intensity aerobic exercise stress conditions, the left ventricular muscle group differences in protein expression and 25 the laws for the study of aerobic exercise impact on myocardial protein to effectively improve the level of cardiac function to provide a basis. Methods: 20 SD male rats were randomly divided into control group and experimental group in order to run the way sport Units, copy incremental exercise load to 24m • min-1, sustained exercise of moderate intensity exercise 40min experimental animal models; the experimental group at at the end of 6 hours after training with the control 30 group, anesthesia executed simultaneously, taking the left ventricular muscle, left ventricular muscle tissue extracts of the whole two-dimensional gel electrophoresis protein separation; use of ImageMaster 2D Platinum image analysis software for 2-DE gel analysis.Results: The left ventricular muscle protein group are separated from the results of the exercise group protein point of 478 ± 7, and the control group was 563 ± 24; exercise differentially expressed proteins after 35 there are a total of 45, these proteins were mainly concentrated in the molecular weight of 10 ~ 70kD, and isoelectric point between 5 ~ 8; 2-fold increase in expression of more than 27 has dropped more than 2 times the point has 16, one of the expression of 5-fold increase of more than seven points, has dropped 5 times Point 5. Conclusion: The moderate-intensity aerobic exercise, the rat left ventricular muscle of the expression of proteins significant changes have taken place. 40 Level of myocardial energy metabolism, exercise rat heart good adaptive changes occur. Keywords: exercise heart; proteome; left ventricular muscle; moderate-intensity exercise; two-dimensional gel electrophoresis 0 引言 45 运动心脏是指由运动训练引起的心脏体积增大、重量增加、每博输出量增加、安静心率 减慢等为特征的大心脏[1]。不同项目、不同强度的运动训练可引起心脏形态结构和功能方面 发生不同的变化。蛋白质是生物体功能的执行者，心肌蛋白质是心脏结构和功能的基础。心 室肌是心脏泵血的主要动力。心肌蛋白质的表达量和质发生变化，必然导致心肌的结构和功 能发生改变。 50 蛋白质组学是从整体的角度研究一个细胞、一种组织或一种生物的基因组所表达的全部 蛋白质的一门学科[2]。国内外医学生物学领域有关重大疾病等的蛋白质组学研究在近几年里 蓬勃兴起。国外，Rogers 等应用差异蛋白质组技术对安静状态和运动训练大鼠左室肌蛋白 进行了研究，发现有显著性差异表达的一组是热休克蛋白和3α-羟基类固醇脱氢酶[3]。Boluyt 等发现，与安静对照组相比，经过6 周的递增运动负荷的耐力运动后诱导的肥大心肌中，有 55 26 个蛋白质点的表达量发生了改变，有12 个点属于新增的蛋白质[4]。国内，史绍蓉的研究 结果表明：运动应激条件下大鼠心房肌蛋白质的差异性表达与心肌组织的信号转导、能量代 谢、物质代谢以及心肌功能的改变有关[5]。弓景波，吴淑庆，钱令嘉在《应激心肌损伤的蛋 白质组学研究》中发现，经过12 周耐力训练后，心房与心室中原癌基因的表达存在明显差 异，心房中原癌基因的表达有明显增高趋势，而心室中原癌基因的表达则显著下降[6]。 60 左心室是心脏泵血中工作负荷量最大的功能部分，本课题从蛋白质组学的角度探讨在中 等强度有氧运动应激条件下，左室肌蛋白质组的差异表达及其规律，为研究有氧运动对心肌 蛋白质的影响、有效地提高心功能水平提供依据。期待为研究运动心脏重塑发生的机制寻找 到新的突破点。 1 材料与方法 65 1.1 仪器设备和试剂 仪器设备与试剂具体参考相关文献[5]。 1.2 研究对象与分组 20 只雄性Sprague-Dawley 大鼠购于湖南农业大学实验动物部，2 月龄，体质量（224±30） g，Ⅱ级试验动物。许可证号为：SCXX(湘)2006-0001。室温20～24℃，光照时间7：00～ 70 19：00，分笼饲养，自由进食和饮水。适应性训练1 周后，20 只大鼠按体质量和运动能力 配对随机分为对照组和实验组，每组10 只。 1.3 运动训练方案 实验动物模型参考常芸的运动心脏动物模型[7]。SD 大鼠购入后，进行跑台适应性训练5 天，训练强度分别为：第一天是10×10m/min，第二天是10×15m/min，第三天是18×15m/min， 75 第四天是21×20m/min，第五天是24×20m/min，第六天按体质量和运动能力配对随机分为对 照组和实验组，每组10 只，此后每天以速度为24m·min-1 训练40min，负荷强度相当于 65-75%VO2max。整个训练过程中，每周运动6 天，周日休息。 1.4 样品制备 1.4.1 取材 80 实验组于末次训练6 小时后与对照组同时做麻醉处理后，固定于手术板上，打开胸腔， 暴露心脏，在主动脉升部插管，用0.85%的生理盐水对心脏进行灌流，待心脏颜色由深红逐 渐变淡后，迅速摘取心脏放入4℃生理盐水中进行冲洗，小心地剔除心外膜，然后用滤纸小 心的吸干水分，从心尖部位剪开后发现室间隔，区分左右心室后，用小剪刀剪取左心室组织， 保存于-80℃超低温冰箱中备用。 85 1.4.2 称重 取材前称取两组大鼠（实验组和对照组）的体重；取材后，先用滤纸吸干心脏表面的水 分后在电子天平上称心重，并计算心重指数。 1.4.3 蛋白提取 从-80℃超低温冰箱中取出左室肌组织，放入碾钵后迅速用小剪刀剪碎，加入适量液氮 90 将左室肌组织充分碾磨至粉末状，用离心管称取200mg 左室肌样本，按质量与体积比1:4 （mg:ul）加入组织裂解液（8 mol/Lurea、2mol/L thiourea、4%CHAPS、1%NP-40、65mol/L DTT、0.5mmol/L PMSF、0.5（v/w）Pharmalate（pH3～10）），4℃振匀30min，使组织充 分裂解后，组织悬液在12000r•min-1，4℃条件下离心30min，取出样品，小心的避开上层 漂浮的脂质层，吸取上清液后合并组内上清。用Bradford[8]法对样品进行蛋白定量，测得对 95 照组蛋白质含量为52.6μg/μl，实验组蛋白质含量为63.0μg/μl。样品每管1mg 分装后，保存 于-80℃超低温冰箱中备用。 1.5 固相PH 梯度-SDS 双向凝胶电泳 参考Gorga 等[9]方法，将电泳参数作适当调整后，进行蛋白质固相pH 梯度-SDS 双向凝 胶电泳(2-DE)。电泳参数如下：50V 低电压水化12h，200V1h，500V 1h，1000V 1h，8000V 100 0.5h，最后电压由8000V 上升到40000V 结束。温度设为20℃。等电聚焦结束后进行两次平 衡各15min。平衡结束后转入第二向SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。先进行8％的浓缩胶电泳， 电流25mA，时间约1.5h，接着进行4.8％分离胶电泳，电流50mA，时间约3h。 1.6 凝胶染色、图像扫描和软件分析 凝胶染色采用改良的考马斯亮蓝染色[10]。运用清华紫光D3000 图像扫描仪透射扫描凝 105 胶。所得图谱借助图像分析软件ImageMaster 2D Platinum 进行详细分析、比较左室肌蛋白 质组的差异表达。蛋白质分子的等电点和分子质量根据Marker 和IPG 胶条pH 标识范围和 低分子质量蛋白标准测算。图像分析包括蛋白质点的检测、背景扣除和点的匹配，蛋白匹配 以对照组的凝胶图像作为参考胶。 1.7 统计分析处理 110 实验数据均采用spss11.0 统计软件处理，所有数据用平均数±标准差（ X ±s）表示。两 组之间比较采用单侧t 检验，P <0.05 为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 大鼠心脏重量变化 4 中等强度有氧运动后，实验组大鼠与相应对照组相比，心脏的重量增加0.62%，而心 115 脏重量指数增加13.9%（见表1）。 表1 心脏重量及心重指数统计表 Table 1 the heart weight and heart weight index statistics 实验组 对照组 变化率(%) 心脏重量（g） 0.97±0.21 1.03±0.16 0.62% 心重指数（mg/g） 2.72±0.33 2.58±0.39 13.9% * P <0.05，与对照组比较。 2.2 双向凝胶电泳图谱分析 120 实验组和对照组大鼠左室肌进行二向凝胶电泳后得到的2-DE 胶中，实验组平均检测到 蛋白质点478±7 个，对照组平均检测到蛋白质点563±24 个。实验组和对照组各重复电泳3 次后进行匹配， 得到实验组平均匹配率为62.48%±0.89%， 对照组平均匹配率为 65.06%±1.78%，获得了较好的重复性。 图1 为对照组和实验组大鼠左室肌2-DE 图谱，图谱显示蛋白质的分子量多集中在 125 10kD～70kD 之间。等电点（pI）值多集中在5.0～8.0 之间。 3 10 3 10 图1 对照组（左）和实验组（右）大鼠左室肌蛋白质2-DE 图谱 130 Figure 1: control group ( left ) and the experimental group (right ) in rat left ventricular muscle protein2-DE map 图2 表示实验组与对照组左室肌蛋白质组的差异表达图谱，图中所标注的点为差异表达 5 倍以上的点。每个点用柱状图表示。柱状图中a,b,c 表示对照组3 张胶，e,f,g 表示运动组 三张胶。纵坐标表示表达强度。从图上可以看出，对照组与实验组的差异表达情况。 135 图2 对照组与实验组左室肌蛋白质组的差异表达图谱 Fig 2the control group and experimental group left ventricular muscle proteome differential expression map 通过软件分析显示，4 周中等强度运动后与对照组相比，共有45 个蛋白质点发生了变 学术论文网Tag： |
