|
【摘要】 糖尿病心肌病是糖尿病患者的主要并发症之一，随着糖尿病患者的逐年增加，糖尿病患者心肌病的发病率也迅速上升，糖尿病心肌病主要以心功能降低，心肌肥大为主要表现，长期发展还可以导致心肌纤维化和心力衰竭的发生。黄连素对2型糖尿病的治疗作用显著，具有降血糖、改善葡萄糖耐量损伤的作用，并且对糖尿病并发症有较好的防治作用。AMPK作为能量调控器，不仅在调节肝脏、脂肪和骨骼肌的糖脂代谢方面发挥着重要的作用，而且也参与了心肌的能量代谢平衡的调节。我们前期的研究工作表明，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，黄连素能够通过对心肌的缺血区和非缺血区的AMPK进行不同的调节来发挥保护心肌损伤，减小心肌梗死面积的作用，并且黄连素对糖尿病大鼠的血管内皮损伤有明显的保护作用，而此作用也是通过调节AMPK来实现的，因此我们推测，黄连素对糖尿病心肌病这一并发症也可能具有保护作用并且与AMPK的关系密切。基于以上原因，本研究在整体水平，观察黄连素对糖尿病心肌病心功能的影响，探讨黄连素对糖尿病心肌病的保护作用；在细胞水平，观察黄连素对胰岛素抵抗的H9c2心肌细胞的糖消耗、糖摄取及AMPK蛋白表达的影响，探讨黄连素是否改善心肌细胞胰岛素抵抗，此外在细胞水平上，观察黄连素对H9c2心肌肥大细胞面积及细胞内AMPK、AKT和GSK-3β蛋白表达的影响，探讨黄连素对H9c2心肌细胞肥大的保护作用及其作用机制。具体从以下几个方面：1.黄连素对糖尿病心肌病的保护作用：采用我们实验室改良后的大鼠2型糖尿病模型，即高脂饮食联合多次小剂量STZ诱导大鼠2型糖尿病，并给予黄连素治疗16周后，检测大鼠的血糖、血脂、胰岛素、葡萄糖耐量、大鼠心功能的超声心动图以及心肌中单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）、胰岛素抵抗相关蛋白AS160/GLUT-4和心肌肥大相关蛋白AKT/GSK-3β的表达情况，整体实验结果证明，黄连素给药后能够明显改善心功能，改善心肌组织形态，改善空腹血糖和胰岛素等相关指标，对心肌组织的相关蛋白检测发现，与DM组相比，黄连素能增加心肌组织中AMPK、AS160的表达及葡萄糖转运体-4（GLUT4）的膜转位，此外，黄连素还能够增加蛋白激酶B（AKT）和糖原合酶激酶（GSK-3β）的磷酸化，整体实验结果说明，黄连素能明显改善2型糖尿病大鼠心肌病的心功能，其保护作用可能与激活AMPK有关。2.黄连素改善H9c2心肌细胞胰岛素抵抗作用及其作用机制：通过高胰岛素诱导建立H9c2的胰岛素抵抗模型，研究黄连素对正常的H9c2心肌细胞及胰岛素抵抗的H9c2心肌细胞的耗糖和糖摄取作用，以及AMPK的蛋白表达的情况，结果表明，黄连素在胰岛素敏感的和胰岛素抵抗的H9c2心肌细胞中都能刺激葡萄糖消耗和葡萄糖摄取，并且应用AMPK的抑制剂能够抑制黄连素对糖摄取和糖消耗的增加作用，说明黄连素刺激葡萄糖消耗与糖摄取的机制主要与AMPK有关。3.黄连素对H9c2心肌细胞肥大的保护作用及其作用机制：通过棕榈酸诱导H9c2心肌肥大模型，并用黄连素干预，应用蛋白染色和软件计算H9c2心肌细胞面积的变化，并应用激光共聚焦方法检测心肌细胞内肥大的特异性因子的表达情况，并对H9c2心肌细胞内AMPK、AKT和GSK-3β的表达情况进一步检测，结果显示，黄连素能降低棕榈酸诱导的心肌肥大细胞的细胞面积，减少心肌肥大标志性蛋白的表达，并且能够增加AMPK，AKT和GSK-3β的磷酸化。本课题主要以AMPK为靶点，分别从整体水平和细胞水平两个大方面研究了黄连素对2型糖尿病心肌病的保护作用以及作用机制，在整体水平，黄连素对大鼠心功能具有明显改善作用且能影响相关蛋白的表达，在细胞水平，本课题从心肌胰岛素抵抗以及心肌肥大两个方面探讨了黄连素对心肌病的保护作用机制，为黄连素作为治疗糖尿病心肌病药物提供理论依据。
【关键词】 糖尿病心肌病； 黄连素； 心肌肥大； AMPK； 胰岛素抵抗； H9c2；
提要 4-6
中文摘要 6-10
Abstract 10-13
英文缩写词表 16-18
第1篇 前言 18-20
第2篇 文献综述 20-40
第1章 糖尿病心肌病 20-27
1. 胰岛素抵抗 21-23
2. 能量代谢障碍 23-24
3. 心肌肥大 24-27
第2章 AMPK 与心血管疾病 27-32
1. AMPK 的结构和调节 27-28
2. AMPK 是能量感受器和调节者 28-30
3. AMPK 与心肌缺血再灌 30
4. AMPK 与糖尿病心肌病 30-32
第3章 黄连素与糖尿病及糖尿病并发症 32-40
1. 黄连素与糖尿病的治疗 32
2. 黄连素对 2 型糖尿病应用的药效观察 32-34
3. 黄连素与糖尿病并发症的治疗 34-35
4. 黄连素治疗糖尿病的机制 35-40
第3篇 实验研究 40-90
第1章 黄连素对糖尿病心肌病的保护作用 40-57
第1节 材料与方法 41-49
1 实验材料 41-42
1.1 药品及试剂 41
1.2 仪器 41-42
1.3 主要溶液配制 42
2 实验方法 42-49
2.1 实验设计及分组 42
2.2 高脂饮食联合多次小剂量 STZ 建立糖尿病模型和糖尿病心肌病模型 42-43
2.3 空腹血糖、胰岛素、总胆固醇及甘油三酯的测定 43
2.4 葡萄糖耐量实验 43
2.5 超声心动图检测心功能 43
2.6 HE 染色 43-44
2.7 Masson 染色 44
2.8 心肌组织蛋白检测 44-48
2.9 统计学分析 48-49
第2节 实验结果 49-57
1 黄连素对糖尿病大鼠空腹血糖、胰岛素、甘油三酯和总胆固醇水平的影响 49
2 黄连素对 2 型糖尿病大鼠血清 MDA、SOD、NO 的影响 49-50
3 黄连素对 2 型糖尿病大鼠腹腔注射葡萄糖耐量（IPGTT）的影响 50-51
4 黄连素对糖尿病心肌病心功能的保护作用 51-52
5 黄连素对糖尿病心肌组织形态 HE 染色的影响 52-53
6 黄连素对糖尿病心肌组织 Masson 染色的影响 53
7 黄连素对糖尿病心肌组织的 p-AMPK, AMPK 的表达的影响 53-54
8 黄连素对糖尿病心肌组织的 AS160，GLUT-4 蛋白膜转位的表达的影响 54-55
9 黄连素对糖尿病心肌组织的 p-AKT, AKT 蛋白的表达的影响 55-56
10 黄连素对糖尿病心肌组织的 p-GSK-3β, GSK-3β 蛋白的表达的影响 56-57
第2章 黄连素对胰岛素诱导的胰岛素抵抗 H9C2 心肌细胞的作用 57-75
第1节 材料与方法 57-64
1 实验材料 57-61
1.1 药品及试剂 57-58
1.2 仪器 58-59
1.3 主要溶液配制 59-61
2 实验方法 61-64
2.1 细胞培养及分化鉴定 61-62
2.2 细胞活性的测定-噻唑蓝法（MTT） 62
2.3 各组给药以及糖消耗的测定 62
2.4 糖摄取的测定 62-63
2.5 胰岛素抵抗模型的建立 63
2.6 免疫印迹（Western Blot） 63
2.7 统计学分析 63-64
第2节 实验结果 64-75
1 H9c2 细胞分化的鉴定 64
2 黄连素对 H9c2 心肌细胞活性的影响 64-65
3 黄连素时间依赖并剂量依赖的增加正常 H9c2 心肌细胞的糖消耗 65-66
4 黄连素对 H9c2 的糖消耗和糖摄取作用与 AMPK 的激活有关 66-68
5 胰岛素抵抗模型的建立 68-70
6 黄连素能促进胰岛素抵抗的 H9c2 细胞的糖消耗和糖摄取 70-71
7 黄连素促进胰岛素抵抗的 H9c2 糖消耗和糖摄取与 AMPK 激活有关 71-74
8 黄连素促进胰岛素诱导的胰岛素抵抗的 H9c2 细胞的糖消耗和摄取与AKT关系不大 74-75
第3章 黄连素对棕榈酸诱导的心肌细胞肥大的保护作用 75-90
第1节 材料与方法 75-84
1 实验材料 75-80
1.1 药品及试剂 75-76
1.2 仪器 76-77
1.3 主要溶液配制 77-80
2 实验方法 80-84
2.1 细胞培养及分化 80
2.2 棕榈酸的配制 80-81
2.3 心肌肥大模型的建立 81
2.4 细胞面积的检测 81
2.5 免疫荧光 81-82
2.6 免疫印迹（Western Blot） 82-83
2.7 统计学分析 83-84
第2节 实验结果 84-90
1 不同浓度棕榈酸对 H9c2 心肌细胞的存活率的影响 84
2 不同浓度棕榈酸对 H9c2 心肌细胞 p-AMPK, AMPK 表达的影响 84-85
3 黄连素对棕榈酸诱导 H9c2 心肌细胞面积增加的影响 85-86
5 黄连素对棕榈酸诱导的 H9c2 心肌细胞的 α-MHC, β-MHC 表达的影响 86-87
6 黄连素对棕榈酸诱导的肥大 H9c2 心肌细胞的 p-AMPK, AMPK 蛋白表达的影响 87-88
7 黄连素对棕榈酸诱导的肥大 H9c2 心肌细胞的 p-AKT, AKT 的表达的影响 88-89
8 黄连素对棕榈酸诱导的肥大 H9c2 心肌细胞的 p-GSK-3β, GSK-3β 的表达的影响 89-90
第4篇 讨论 90-98
第1章 黄连素对糖尿病心肌病的保护作用 90-92
第2章 黄连素对胰岛素抵抗的 H9C2 的心肌细胞的保护作用 92-95
第3章 黄连素对棕榈酸诱导的 H9C2 心肌细胞肥大的保护作用 95-98
第5篇 结论 98-99
创新点 99-100
参考文献 100-112
攻读博士期间发表的学术论文 112-114
致谢 114
学术论文网Tag： |
