【摘要】 原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是世界第5位高发的肿瘤，也是致死率第3位的恶性肿瘤，其中70%-85%为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。肝细胞癌由于缺乏有效的治疗手段，严重威胁着人类生命和健康。随着现代分子生物学技术和基因工程技术的迅速发展，为肝癌的生物治疗开辟了全新的领域。生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四种模式，并显示出了良好的应用前景，主要包括：分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、内分泌治疗、细胞治疗等。分子靶向治疗是通过靶向肿瘤细胞表面特异性分子的配体与药物、放射性核素或生物毒素等偶联，靶向杀伤肿瘤细胞。由于其能选择性作用于肿瘤局部，具有疗效高、副作用小等优点。其中，基于特异性抗体、偶联化疗药物的肝癌靶向治疗成为新的研究热点。抗体靶向治疗的关键因素之一是高特异性肿瘤抗原的筛选。理想状态下，它应在肿瘤细胞高表达，而在正常组织中不表达，并且其与相应抗体结合后有较好地内化能力，能够使与之结合的抗体很快内化入细胞中，进而使抗体携带的药物能够特异性地进入肿瘤细胞中而发挥作用。已有研究表明HCC的发病机制十分复杂，其发生、发展和转移与多种基因的突变、细胞信号传导通路和新生血管增生异常等机制密切相关，其中多个关键性环节，是进行抗体靶向治疗的理论基础和潜在的重要靶点。研究表明，肝细胞生长因子（hepatocyte growthfactor，HGF)可与其受体c-Met结合，该信号通路在肝癌的形成、侵袭、转移等过程中都发挥着重要作用，c-Met在肝癌组织中高表达，而在其他正常组织中低表达或不表达，因此，c-Met可作为肝癌靶向治疗的重要靶点，将成为肝癌治疗的一个新途径。目前临床化疗药物的品种较多，其中阿霉素是临床最早使用的肿瘤化疗药物之一，使用范围广，是肝癌化疗的常用药物之一，但是其毒副反应较大，最常见的是心脏毒性和骨髓抑制，限制了其在临床肿瘤治疗中的应用。本研究旨在将抗c-Met抗体与阿霉素偶联，利用抗体的靶向性，有效地将药物靶向到肿瘤部位，有希望降低阿霉素剂量，减轻化疗不良反应，提高化疗效果。为此，本课题研究内容如下：1．全人源免疫型Fab噬菌体抗体库的构建2．人源抗c-Met Fab抗体的筛选、表达和鉴定3．人源抗c-Met Fab抗体分子与阿霉素的偶联及偶联物特性分析4．人源抗c-Met Fab-阿霉素对肿瘤细胞的细胞毒作用分析5．人源抗c-Met Fab-阿霉素对荷人肝癌移植瘤裸鼠的体内抑瘤效果分析6．人源抗c-Met Fab-阿霉素在荷人肝癌移植瘤裸鼠体内的定位及分布研究方法：1．分离肝癌患者外周血淋巴细胞，扩增所有的抗体重、轻链可变区基因，构建全人源噬菌体抗体库。基于细胞表面抗原的差减筛选，对构建的噬菌体抗体库进行富集筛选，制备人源抗c-Met Fab质粒，并测定抗体的基因序列。2．重组质粒pComb3X-MetFab，转入大肠杆菌诱导表达Fab，通过诱导条件的优化，筛选最适条件大量表达，选择合适条件采用Protein L亲和柱纯化细菌超声裂解上清，并对纯化后的人源抗c-Met Fab抗体进行鉴定。3．用化学合成的方法，将人源抗c-Met Fab抗体和阿霉素偶联，得到偶联产物MetFab-DOX，并用HPLC进行初步鉴定。通过FACS、细胞ELISA及免疫荧光检测，分析MetFab-DOX对c-Met不同表达水平细胞的结合能力。同时观察MetFab-DOX中阿霉素进入细胞内的过程，并与游离阿霉素进行比较。4．将MetFab-DOX及游离阿霉素分别作用于c-Met阳性表达的肝癌细胞和c-Met阴性表达的细胞，MTT法检测MetFab-DOX、游离阿霉素对细胞的毒性作用，并比较分析二者对不同c-Met表达水平细胞毒性作用的差异。5．建立人肝癌移植瘤裸鼠模型，分别应用MetFab-DOX和高、低剂量阿霉素进行治疗，观察MetFab-DOX与阿霉素的抑瘤效果，并比较二者化疗药物毒副作用的差异。6．裸鼠肝癌移植瘤组织冰冻切片，免疫荧光观察MetFab-DOX在肿瘤组织中的定位。用Cy5.5进行标记MetFab，运用活体成像技术观察MetFab在荷瘤小鼠中的定位。荷瘤裸鼠分别注射游离阿霉素和MetFab-DOX，荧光分光光度法测定并比较给药后不同时间点阿霉素在动物体内各主要脏器和肿瘤组织中的分布。研究结果：1．构建了全人源免疫型Fab抗体库，库容量为2.0×109。筛选出1株人源抗c-Met Fab抗体，并进行了序列测定。选择诱导前加入2%葡萄糖、SB培养基、25℃、1mmol/L IPTG作为最佳诱导表达条件，以最适条件进行Protein L柱的亲和纯化，最终得到纯度较高的人源抗c-Met Fab抗体，产量可达5mg/L。2．采用化学键合的方法将人源抗c-Met Fab抗体分子与阿霉素偶联，分离纯化得到偶联物MetFab-DOX，HPLC分析结果证实二者偶联成功。体外释放实验表明，在pH7.2中性条件下，MetFab-DOX比较稳定，240h累积释放率约为16.9%；在pH4.0酸性条件下，MetFab-DOX能较快释放出游离的阿霉素，96h累积释放率为81.3%，远高于pH7.2时96h的累积释放率12.1%。3．FACS分析表明MetFab-DOX能与不同c-Met表达水平的肝癌细胞特异性结合，抗体的结合效率因细胞表面c-Met表达水平的差异而不同，且与不表达c-Met的NIH3T3细胞基本不结合，显示了较好地靶向性。通过细胞免疫荧光及细胞ELISA检测，证实MetFab-DOX与MetFab具有相同的特性，能与表达c-Met的肝癌细胞特异性结合。跟踪阿霉素的红色荧光观察到MetFab-DOX进入细胞并且释放阿霉素的过程与游离阿霉素不同。游离阿霉素可较快地直接进入细胞核，对细胞无选择性；而MetFab-DOX先与细胞表面的c-Met结合，进入胞浆释放阿霉素定位到核上，具有较好地靶向性。4．对c-Met阳性表达的肝癌细胞，MetFab-DOX及游离阿霉素都具有细胞毒性作用；对c-Met阴性表达的NIH3T3细胞，游离阿霉素有较强的细胞毒性作用，而MetFab-DOX几乎无细胞毒性作用。5．分别用MetFab-DOX和游离阿霉素进行裸鼠人肝癌移植瘤模型的研究，观察到MetFab-DOX与游离阿霉素对肿瘤生长都有明显抑制作用，阿霉素高剂量组的平均抑瘤率为90.38%，阿霉素低剂量组为59.67%，MetFab-DOX组为65.40%。同时MetFab-DOX能明显减轻阿霉素单独给药所引起的体重下降，与阿霉素高、低剂量组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。MetFab-DOX还能明显减轻阿霉素所引起的心、肺、肾的毒副作用。6．肿瘤组织免疫荧光检测发现，MetFab-DOX能够结合在肿瘤局部。活体成像实验结果表明MetFab能够富集于肿瘤局部，并且注射后48h仍能够在肿瘤局部观察到MetFab-Cy5.5的荧光。荧光分光光度法检测结果显示，给药后，MetFab-DOX组裸鼠肿瘤组织中的阿霉素含量均高于游离阿霉素给药组，而其心脏及肾脏中的阿霉素含量均低于游离阿霉素给药组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：本课题筛选出1株人源抗c-Met Fab抗体，并成功将其与阿霉素进行偶联，制备MetFab-DOX。MetFab-DOX不仅对体外培养的肝癌细胞有细胞毒作用，而且在肝癌的裸鼠模型中，能特异性靶向肿瘤细胞，对肝癌移植瘤生长有明显的抑瘤效果，同时明显减轻了阿霉素的毒副作用。该研究结果为该抗体偶联化疗药物应用到肝癌的临床治疗奠定了基础，为肝癌分子靶向治疗提供了一个候选靶向药物。 

 

【关键词】 c-Met； 阿霉素； 抗体库； 肝癌； 抗体化疗药偶联； 靶向治疗；