【摘要】 第一章microRNA-210在肾脏透明细胞癌中的表达及其与临床病理分期、分级的相关性研究目的：探讨microRNA-210(miR-210)在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)中的表达及其意义。方法：用实时定量PCR技术检测15例ccRCC及癌旁非肿瘤组织中miR-210的表达情况,研究其与ccRCC病理分期、分级之间的关系。结果：实时定量PCR发现,15例ccRCC患者与配对的癌旁非肿瘤组织相比,miR-210在肿瘤组织中的表达100%上调,其中miR-210在ccRCC中的相对表达量为7.16±0.63,在癌旁非肿瘤组织中相对表达量2.27±0.54,两者表达有显著统计学差异(P<0.01)15例ccRCC标本中,根据病理分期分级进行分组,Ⅰ期肾癌中miR-210的相对表达量为7.24±0.66,Ⅰ-Ⅲ期肾癌中为7.60±0.64,两者相比没有显著差异(P>0.05)。高分化组肾癌中miR-210的相对表达量为7.06±0.69,中-低分化组肾癌中为7.21±0.63,两者相比没有显著差异(P>0.05)。结论：1、ccRCC (?)中miR-210的表达水平较癌旁非肿瘤组织明显上调,暗示miR-210可能参与ccRCC的发生发展,miR-210表达水平的检测有助于肾癌早期诊断。2、ccRCC中miR-210的表达水平与病理分期分级无关。目的：miR-210对缺氧状态下肾癌细胞细胞增殖、侵袭能力和细胞凋亡等生物学性状的影响。方法：实时定量PCR检测常氧、缺氧状态下肾癌细胞株(ACHN)中及正常肾小管上皮细胞株(HK2)中miR-210的表达。采用LipofectamineTM2000转染hsa-mir-210inhibitor于缺氧48h的肾癌细胞株ACHN中,敲低miR-210的表达,实时定量PCR检测转染后miR-210表达,MTT法、Transwell侵袭实验和Annexin V/PI双染法分别观察细胞增殖、侵袭能力及细胞凋亡的变化。结果：常氧状态下正常肾小管上皮细胞株HK2和肾癌细胞株ACHN细胞中miR-210的相对表达量分别为1.47和3.43。缺氧状态12h、24h和48h肾癌细胞株ACHN细胞中miR-210的相对表达量分别为4.59、5.30和7.20。肾癌细胞ACHN常氧组,缺氧组,缺氧抑制组3组比较实验,缺氧抑制组转染sa-mir-210inhibitor,缺氧条件下培养48h后,结果显示与缺氧组相比,缺氧抑制组中miR-210的相对表达量显著降低(P<0.05)。用MTT法检测细胞的生长抑制率,细胞侵袭实验检测其侵袭能力,流式细胞术检测其凋亡率,发现转染hsa-mir-210inhibitot12h、24h、48h后,在各个时间点和常氧组相比,缺氧组细胞相对存活率显著升高(P<0.05)；在各个时间点和常氧组及缺氧组相比,缺氧抑制组细胞相对存活率显著降低(P<0.05)。Transwell侵袭实验结果显示在各个时间点和常氧组相比,缺氧组侵袭细胞数显著增加(P<0.05)；在各个时间点和常氧组及缺氧组相比,缺氧抑制组侵袭细胞数显著减少(P<0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示在各个时间点和常氧组相比,缺氧组凋亡率显著降低(P<0.05)；在各个时间点和常氧组及缺氧组相比,缺氧抑制组凋亡率显著增高(P<0.01)。结论：1、缺氧诱导miR-210在肾癌细胞中表达上调。2、hsa-mir-210inhibitor能有效的转染于肾癌细胞中,降低肾癌细胞中miR-210的表达。3、缺氧增强肾癌细胞的增殖和侵袭能力,并且减少细胞凋亡。4、敲低miR-210表达抑制了缺氧状态下肾癌细胞ACHN的增殖和侵袭能力,并且诱导细胞凋亡。目的：探讨miR-210调控缺氧状态下肾癌细胞ACHN的分子学机制方法：通过生物信息学方法预测miR-210的靶基因,通过实时定量PCR及Western blot分别检测常氧组、缺氧组和缺氧抑制组中的miR-210的表达量及靶基因的表达。结果：选择TargetScan、PicTar、mirbase和miRanda这4个软件对miR-210进行靶基因预测,VMP1、HOXA9、CBX7、FGFRL1和VAV3均为其可能的靶基因。运用实时定量PCR技术,检测转染48h后常氧组,缺氧组和缺氧抑制组中miR-210的相对含量,结果显示和肾癌细胞缺氧组相比,miR-210的相对含量在缺氧抑制组显著下调。靶基因实时定量PCR结果显示VMP1的相对表达量在常氧组、缺氧组和缺氧抑制组ACHN细胞中分别为3.3408±0.4391,1.3457±0.5235和2.2383±0.1785,三组相比有显著性差异(P<0.05)；FGFRL1的相对表达量在三个组中分别为1.5235±0.7928,1.0996±0.3853和2.6076±0.4544；与缺氧组相比,缺氧抑制组中FGFRL1的相对表达量显著性上调(P<0.05)；HOXA9、CBX7和VAV3在三个组中表达无显著性差异。Western blot结果显示HOXA9的蛋白表达比值(HOXA9/GAPDH)在3个组分别为0.283±0.016,0.535±0.021和0.509±0.024,缺氧组与常氧组相比HOXA9的蛋白表达比值显著性上调(P<0.05),而缺氧组与缺氧抑制组相比无显著性差异(P>0.05)；FGFRL1的蛋白表达比值(FGFRL1/GAPDH)在三个组中分别为0.208±0.01,0.151±0.01和0.471±0.11,缺氧组与常氧组相比FGFRL1的蛋白表达比值显著性下调(P<0.05),缺氧抑制组与缺氧组相比FGFRL1的蛋白表达比值显著性上调(P<0.05)。VMP1、CBX7和VAV3在三个组中表达无显著性差异。结论：1、缺氧状态下肾癌细胞中FGFRL1基因和蛋白表达与miR-210的表达呈负相关性；VMP1基因表达与miR-210的表达呈负相关而蛋白表达量与miR-210的表达无关；HOXA9、CBX7、和VAV3基因、蛋白表达与之无明显关系。2、FGFRL1为miR-210在缺氧状态下肾癌细胞中可能的靶基因,而VMP1、HOXA9、CBX7和VAV3非miR-210的靶基因。 

 

【关键词】 肾透明细胞癌； microRNA-210； 分期； 分级； 缺氧； 细胞增殖； 细胞凋亡； 细胞侵袭； 靶基因； FGFRL1；